相关光学和带电粒子显微镜的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种被装配成执行相关光学显微术和带电粒子显微术的装置，该装置包括:
?带电粒子柱(column),示出用于沿着粒子光轴产生一束带电粒子的带电粒子源和包括用于使所述带电粒子束聚焦的两个极靴的磁性物镜，
?样本位置，位于极靴之间，
? 一种用于对位于样本位置处的薄平样本进行成像的光学显微镜，该光学显微镜示出了垂直于粒子光轴的光轴，
?样本保持器，用于将薄平样本保持在其中可以用粒子光轴对薄平样本进行成像的取向中和在其中薄平样本垂直于光轴的另一取向中，
本发明还涉及一种使用此类装置的方法。
【背景技术】
[0002]根据美国专利号US7，671，333已知此类装置。本已知专利描述了一种具有安装在其中样本所存在的平面中的可缩回扫描光学显微镜(SOM)的透射式电子显微镜(TEM), SOM的光轴垂直于且横断TEM的电光轴。通过使样本朝着光学显微镜倾斜，可以通过用扫描激光束来照射样本而实现荧光图像。此射束激发样本中的荧光标记。响应于所述激励，生成光子，其被光学透镜的物镜所收集且随后被检测。使得这些标记附着于例如组织的特定部分，作为其结果，荧光图像示出例如脂质层或特定酶等。此信息然后被用来限定用于TEM的感兴趣区域。
[0003]应注意的是在TEM中，不需要在样本垂直于TEM的粒子光轴的同时对其进行成像，而是常常以不同的角度成像，例如当制作断层照片时。在极端情况下，在样本相对于垂直位置以例如70度倾斜的同时对其进行成像。
[0004]还应注意的是还已知使用相关显微术，将来自光学和电子显微术的不同种类的信息组合。
[0005]值得提到的是在透射电子显微术中也使用标记，但是通常这些包括重金属(例如金或银簇(cluster)),在生物材料方面由于其高Z组成而形成对比。还已知例如金纳米粒子的使用，其充当荧光标记和重金属标记两者。
[0006]SOM的使用是相当昂贵的，并且非扫描显微镜的使用从金融角度来说将是优选的。然而，已知专利认为这是不切实际的，因为透镜杆(pole)之间的空间是有限的，并且安装在透镜杆之间的透镜必要地在其数值孔径(NA)方面被限制。
[0007]NA被定义为sin( Θ )，其中Θ是最大接受角，并且采取等于一的折射率(η = I)，如在空气和真空中的情况一样。
[0008]因此，已知专利针对使用没有色彩修正的简单透镜。
[0009]而且，即使SOM并未遭受色像差(chromatic aberrat1n),由于与位置准确度有关的激发光束是单色的，所以等于0.61 λ /NA的衍射限制分辨率极限受到透镜的NA的限制，如灵敏度一样，其与物镜的接受立体角成比例，因此与(NA)2成比例。
[0010]另一此类装置是具有由美国俄勒冈州Hillsboro的FEI公司出售的iCorr?的商售 Tecnai ?,如在产品数据表 DS0126-12-2012 “Tecnai ? with iCorr ? , enablingcorrelative microscopy on the Tecnai TEM”中所描述的。此类仪器也称为相关光-光学和电子显微镜(CLEM)。此装置使用与透射式电子显微镜相结合的基于LED的荧光显微镜。在其中薄平样本垂直于光光轴(light optical axis)的第二取向上，光显微镜在反射和/或荧光模式下收集图像。此装置将标准、非扫描装备(set-up)用于荧光显微镜且因此需要消色差物镜。此类透镜比单色物镜更加复杂得多，并且物镜是15X/0.5 NA透镜，因为更大透镜(具有更高NA)并未安装在杆件之间。
[0011]0.5的此透镜的NA限制荧光显微镜的分辨率:衍射限制分辨率等于0.61 λ /NA，其中，λ是光的波长。
[0012]由于物镜的接受立体角是受限的，所以灵敏度也是受限的(灵敏度与透镜所接受的立体角成比例，因此与NA2成比例)。
[0013]存在对一种具有改进光学显微镜的装置的需要，其在磁性透镜的杆件的物理约束内提供与高灵敏度组合的高分辨率。
【发明内容】
[0014]本发明旨在提供一种装配有此类改进光学显微镜的装置以及一种用于使用装配有此类改进光学显微镜的装置的方法，而不改变磁性透镜的杆件或所述杆件之间的距离。
[0015]为此，根据本发明的装置的特征在于光学显微镜具有物镜，其是非旋转对称的且被截短以安装在磁性物镜的杆件之间，并且平行于粒子光轴的尺寸小于垂直于粒子光轴的尺寸，从而在两个方向上示出不同的数值孔径以及由此的在两个方向上的不同分辨率，并且用于收集光的接受立体角大于安装在杆件之间的最大旋转对称透镜的接受角。
[0016]在下文中，透镜的ΝΑ(Φ)可以是Φ的函数，其中Φ是垂直于光轴的透镜取向。因此，一个取向上的透镜的ΝΑ(Φ)可以不同于另一取向上的同一透镜的NA。由于透镜被截短以安装在杆件之间，所以在平行于粒子光轴的方向上的NA将是最小NA，而与之垂直发生最大NA。
[0017]本发明是基于这样的理解，即旋转对称透镜的直径在物理上限制磁性透镜杆之间的接近(access)。较大直径仅在与样本位置具有较大距离的情况下是可能的，并且因此用较大的直径并未改善接受立体角(以及由此的灵敏度)。其也适用于分辨率。
[0018]发明人认识到通过例如通过对透镜的一部分进行截短来使得透镜非旋转对称或者使用卵形透镜，可能具有较大接受立体角(因此:灵敏度)以及在一个方向上比在另一方向上更高的衍射限制分辨率(与最大直径相关联的取向示出最高分辨率)。
[0019]应注意的是“非旋转对称”在这里意味着透镜的前表面并未示出旋转对称。本文并不旨在暗示透镜是示出并非旋转对称的焦距的透镜，诸如在圆筒形透镜的情况下发生的。
[0020]应注意的是通过限定在两个方向上具有不同ΝΑ(Φ)的透镜，假设此透镜限定射束限制，并且如果其它光学元件呈现物理限制，则也将这些截短。
[0021]应注意的是美国专利申请公开号US2013/0119267A1公开了一种具有用以使激光束聚焦到样本上的光学部件的样本保持器。在其
[0019]段中，其提到了也可以将这些部件用于阴极发光的检测。该光学系统被配置成与垂直于粒子束取向的样本一起工作。该公开并未公开在样本远离粒子束倾斜的同时用于样本的光学显微检查或成像的光学系统。
[0022]欧洲专利申请EP1724809A1公开了一种用以形成样本的光学图像的非球面(a-spherical)透镜。该光学系统被配置成与垂直于粒子束取向的样本一起工作。样本未被放置在粒子光学显微镜的物镜的杆件之间。
[0023]美国专利申请公开号US2008/0283777A1公开了又一光学系统，包括被配置成与垂直于粒子束取向的样本一起工作的反射镜/棱镜。样本未被放置在粒子光学显微镜的物镜的杆件之间。
[0024]在实施例中，样本保持器在第二取向上被装配成在垂直于光轴的平面中使样本旋转超过90度。
[0025]当制作一个图像时，由于两个方向上的物镜的NA方面的差异，图像将在一个方向上示出比在与之垂直的方向上更好的(衍射限制)分辨率。现在通过为装置装配可以在垂直于光轴的平面中使样本旋转超过90度的样本保持器，可以形成两个图像，每个在垂直于另一个的最佳分辨率的方向上具有其最佳分辨率。
[0026]通过将两个图像组合，可以形成具有比可用未截短透镜获得的分辨率更好的分辨率的图像。此类组合可以通过例如将每个图像的傅立叶变换相加且然后使用相加的傅立叶变换来重构图像而实现。这可以是相互垂直的两个图像的相加，而且也可以是在不同角度下的许多图像的相加。
[0027]应注意的是可以在傅立叶变换之前或者在傅立叶变换之后执行对准，但是明显地应在将图像组合之前完成。
[0028]技术人员将认识到的是本实施例还包括超过两个图像的成像、对准和组合，每个图像具有不同的取向。
[0029]在优选实施例中，带电粒子源是电子源且带电粒子束是电子束。
[0030]本实施例包括装配有透射式电子显微镜(TEM)柱、扫描透射式电子显微镜(STEM)柱或能够作为STEM和TEM柱(也被称为(S) TEM柱)进行操作的柱的装置。
[0031 ] 在另一实施例中，光学显微镜的物镜是可缩回的。
[0032]通过使得透镜可缩回，透镜的玻璃表面在用粒子光束进行成像期间被从样本位置去除。从而，避免了非期望效果，诸如由于例如电子而引起的透镜表面的充电。还避免了可能导致降低的透镜透明度的透镜污染。
[0033]在又一实施例中，用薄导电透明层、更具体地一层氧化铟锡(ITO)来涂敷物镜的至少一部分。
[0034]通过使得面对带电粒子束的物镜的表面导电，避免了充电。
[0035]在本发明的一方面，根据本发明的使用装置的方法包括步骤:对样本进行定位，使得表面面对光学显微镜；以及用光学显微镜获得第一图像，其特征在于在获得第一图像之后，使样本在垂直于光轴的平面中旋转，并且用光学显微镜来获取第二图像；以及使第一和第二图像对准并组合以形成与第一图像在平行于粒子光轴的方向上示出的相比具有更高分辨率的图像。
[0036]在本方法的实施例中，旋转是超过90度的旋转。
[0037]在本方法的另一实施例中在使用光学显微镜获取图像之后且在用带电粒子柱获取图像之前使物镜缩回。
[0038]例如为了避免充电，优选地在形成带电粒子图像之前使光学显微镜的物镜缩回以避免由于透镜的充电而引起的射束扰动，并避免透镜上的污染。
[0039]在又一实施例中，组合包括形成每个图像的傅立叶变换，将傅立叶变换相加，并基于相加傅立叶变换而重构图像。
[0040]优选地，执行加权，使得图像中的每个中的高频信息被增强，使得在重构图像中，正确地表示高空间频率。
[0041]在又一实施例中，组合包括首先将图像相加且然后抑制每个的低频或首先抑制图像中的每个中的低频且然后将图像相加。
[0042]这具有与先前提到的傅立叶变换几乎相同的效果。可以通过用高通内核(highpass kernel)来处理图像而执行抑制。在组合(相加)图像中可以实现类似的结果。
[0043]在该方法的又一实施例中，该方法还包括使用粒子光学柱来获得图像。
[0044]优选地，此高分辨率图像(其可以是光学反射图像、荧光图像、拉曼图像等)的形成后面是使样本在垂直于粒子光轴的平面中旋转并用带电粒子柱来形成图像，更具体地电子光学图像。
【附图说明】
[0045]现在使用附图来进一步阐述本发明，其中相同的参考数字指的是对应特征。
[0046]为此:
图1示意性地示出了装配有光学显微镜的透射式电子显微镜的