一种基于螺环材料的胆固醇生物传感器的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物传感器的制备，尤其涉及一种基于螺环材料的胆固醇酶生物传感 器的制备。
【背景技术】
[0002] 胆固醇是一种可广泛存在于生物体的脂肪物质。它有助于构成细胞膜并保护哺乳 动物细胞受到外来物质的破坏。健康人的血清总胆固醇水平应低于200 高 胆固醇水平会导致致命的疾病，如动脉粥样硬化、脑血栓形成、冠状动脉心脏病和心肌梗 死，所以，分析开发一个高度敏感的胆固醇生物传感器，特别胆固醇浓度的检测，对临床诊 断是很有意义的。
[0003] 最近，为了满足病人的需要，胆固醇检测技术发展迅速。有许多方法可以用来检测 血浆中的胆固醇，如荧光法，高效液相色谱法和电化学法。而电化学生物传感器因其成本 低、快捷、方便引起了极大关注。越来越多的研究人员致力于制备特殊修饰的电极用于胆固 醇的检测。
[0004] 大部分胆固醇生物传感器是基于过氧化氢(h2〇2)的电化学还原而制备的。例如，胆 固醇氧化酶(ChOx)和辣根过氧化物酶被修饰在生物传感器上，进而催化产生过氧化氢和4-胆甾烯-3-酮即胆固醇的氧化还原产物。因此，在检测胆固醇时，提高酶活性是最具吸引力 的。
[0005] 羧甲基纤维素(CMC)是一种良好的成膜材料，并且生物分子可牢固的吸附于纤维 素纤维上，从而固定。
[0006] 螺环材料因其具有两个互相垂直的平面、无定形的性质和多个修改站点等性质而 极具吸收力。螺环化合物不仅表现出显著的抗蛋白尿、抗肥胖、抗肿瘤特性，而且还可以应 用于不对称催化、电化学传感器、耐火材料、发光材料、光伏电池等。
[0007] 在过去的几十年里，螺环化合物因其优秀的发光和电学性能被用作蓝色磷光有机 发光器件(PhOLEDs)的宿主材料。众所周知，制备好的电化学传感器的关键在于电极的电学 性能。胆固醇传感器应具有空穴传输能力、无色散和双相载体运输等属性。近年来，标准的 电化学技术，如循环伏安法(CV)，是决定生物材料有效性的准确方法。本专利的目的是提出 一个新型的使用螺环化合物修饰的电极并用于胆固醇的检测。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种基于螺环材料的胆固醇生物 传感器的制备方法，结合电化学技术，利用有螺环材料合成简易、出色的电学性能和传感器 制备简单等特性，获得工艺简单、低成本的胆固醇生物传感器的生产方式。
[0009] 为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为： 一种基于螺环材料的胆固醇生物传感器的制备方法，包括以下步骤： 步骤1，取洗净的导电基底，在其基底层的导电面上均匀涂布介质层，再在相对湿度为 30%-40%、温度为18°C-28°C下干燥得半成品，其中介质层由螺环材料与生物粘合剂材料按 照体积比1:1-4混合后涂布而成； 步骤2，配制0.5-20mg · ml/1的胆固醇氧化酶溶液，取2-7yL的胆固醇氧化酶溶液均匀 涂布在介质层上，再在相对湿度为30%-40%、温度为18°C_28°C下干燥形成酶层，即完成生物 传感器的制备。
[00? 0]作为制备方法改进的是，所述的螺环化合物为2-氰基螺[荷-9，9 氧杂蒽](spiro [fluorene-9，9，-xanthene]-2-carbonitrile，CNSFX)、2，7-二氛基螺[荷-9，9，-氧杂蒽] (spiro[fluorene_9，9，-xanthene]_2，7-dicarbonitrile，DCNSFX)、2，-氛基螺[荷-9，9 氧杂蒽](spiro[fluorene_9，9，-xanthene]_2 '-carbonitrile，2 '-CNSFX)、2，，7，-二氛基 螺[荷_9，9，-氧杂蒽](spiro[fluorene_9，9，-xanthene]_2，，7 '-dicarbonitrile，2，，7 DCNSFX)、2，3 '，6 '，7-四氛基螺[荷-9，9 氧杂蒽](2，3 '，6 '，7- tetracarbonitrilespiro [fluorene-9，9 ' -xanthene]，TTCNSFX)、2 氛基螺[二苯并[c，h]氧杂蒽-7，9 荷](2 ' -carbonitrilespiro[dibenzo[c，h]xanthene_7，9'-fluorene]，CNSFDBX)、2 '，7二氛基螺 [二苯并[c，h]氧杂蒽-7，9'-荷](2',7dicarbonitrilespiro[dibenzo[c,h]xanthene-7，9 ' -f luorene]，DCNSFDBX)，且结构式如下所示：
作为制备方法改进的是，步骤1中介质层由螺环化合物的悬浮液与生物粘合剂溶液按 照体积比1:2混合后涂布而成。
[0011] 作为制备方法改进的是，步骤1中所述的生物粘合剂为羧甲基纤维素、壳聚糖或全 氟化膜。
[0012] 作为制备方法改进的是，步骤2中胆固醇氧化酶溶液的配制分为两步:第一步，称 取0.05-2mg的胆固醇氧化酶，溶于10yL，pH为5-9的磷酸缓冲液，得胆固醇氧化酶的储备液； 第二步，取lyL的胆固醇氧化酶的储备液，加入9yL，pH为5-9的磷酸缓冲液制成。
[0013] 作为胆固醇氧化酶溶液优选的是，第一步和第二步中所述磷酸缓冲液的pH均为7。
[0014] 有益效果 与现有技术相比，本发明具有的优势有： 首先，传统的用于检测胆固醇的生物传感器大多数使用的是胆固醇氧化酶(ChOx)和过 氧化物酶等的酶对，而本发明使用新型的螺环材料、螺环化合物可替代过氧化物酶，催化过 氧化氢分解，并收集、传递氧化氢分解产生的电子、加快酶促反应速率。
[0015] 其次，相对于传统的两酶系的生物传感器，本发明只使用一种，既降低了传感器的 成本，又提高了传感器的稳定性。
[0016] 最后，本发明的传感器，制备方法简单、制备方面要求的环境宽松，对便携式的家 庭及临床胆固醇检测设备的开发、推广具有深远意义。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1为基于螺环材料的胆固醇生物传感器的结构示意图，其中，1、基底层，2、介质 层，3、酶层； 图2为基于螺环材料的胆固醇生物传感器的检测体系说明图，其中，1、参比电极，2、对 电极，3、工作电极，即裸电极或螺环材料电极，检测时，向柱形容器中加入缓冲液或胆固醇 溶液。
[0019] 图3在50mVS4扫描速度的条件下，制备的螺环材料电极在pH为5.8、6.0、7.0、7.4、 8·0的含0· 1M KC1的5mM [Fe(CN)6] -4Λ3溶液中的循环伏安曲线，当溶液pH为7·0时，电极信 号最佳。
[0020] 图4在50mVs-1扫描速度、溶液pH为7.0的条件下，制备的螺环材料电极DCNSroBX/ ΙΤ0在PBS(a)中和双氧水溶液中（b)的循环伏安曲线； 图5在δΟπιν^Γ1扫描速度、溶液pH为7.0的条件下，制备的螺环材料电极ChOx/DCNSFDBX/ ΙΤ0 在PBS(a)中、制备的螺环材料电极DCNSFD