一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析领域，具体涉及一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法 及其专用特异荧光探针。
【背景技术】
[0002] G蛋白偶联受体40(G protein-coupled receptor 40，GPR40)，又称为游离脂肪酸 受体1 (Free fatty acid receptor 1，FFAR1)，是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联 受体。研究发现，GPR40在调节胰岛素分泌中发挥重要作用，如在胰岛辟田胞中，GPR40可被游 离脂肪酸激活，促使细胞内钙离子浓度升高，进而促进胰岛素释放。因此，以GPR40作为治疗 糖尿病的药物靶标分子是当前国内外研究的热点，已有大量的研究工作致力于筛选能够作 用于GPR40的药物，但是能够用于定量检测化合物与GPR40直接结合能力的方法则比较少。
[0003] Duncan等通过检测GPR40调控的细胞内钙离子浓度上升研究化合物与GPR40的结 合作用，但是该方法只能间接的反应化合物能够作用于GPR40，并不能给出化合物与GPR40 的直接结合能力，且在实验操作过程中，存在很多因素都会导致细胞的钙离子浓度变化。简 单的通过钙离子浓度的变化反应化合物与受体的作用可能会造成假阳性的结果。此外，对 于某些GPR40的抑制剂，其能够与受体结合，但并不会导致细胞内钙离子变化。因此，通过钙 离子浓度的变化研究某些具有抑制作用的化合物与GPR40受体的作用时，可能会造成假阴 性的结果。Lin等通过对GPR40已知的配体AMG837和AM1638进行放射性标记，得到了放射性 探针[ 3H]AMG 837和放射性探针[3!1]舰1638。版1^6等通过对GPR40的配体L358进行放射性标 记得到了 [3H]L358。放射性标记探针方法的优点是灵敏度很高，但是放射性探针危害较大， 操作复杂，对操作人员技术要求高，难以推广使用。Hara等证明一种焚光分子标记的脂肪酸 (C1-B0DIPY-C12)可以作为检测化合物与GPR40结合能力的荧光探针。荧光探针相对放射性 探针没有危害性，但该方法也需要将GPR40蛋白从细胞膜上分离提取，容易造成受体蛋白失 活，同时需要采用免疫反应将GPR40固定到磁珠上，操作比较复杂。上述研究人员开发的放 射性探针和荧光探针虽然能够与GPR40结合，但是在GPR40上的结合位点是未知的，因此，研 究化合物与GPR40结合作用时，其在GPR40上的结合位点也是不明确的，难以对化合物的作 用效果和作用机理进行深入研究。可见，设计针对GPR40的特异性探针，建立定性定量的检 测化合物与GPR40结合能力的方法，对有效的筛选和研究化合物与GPR40的结合与效应具有 重要意义。
[0004] Srivastava等（Srivastava et al .Nature，2014,513:124-139)通过蛋白晶体结 构得到GPR40与TAK-875形成复合物的晶体结构，这是目前唯一解析的GPR40与配体的复合 物晶体结构。晶体结构的结果明确的给出TAK-875在GPR40的特异性结合口袋位置。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何检测待测样品与GPR40结合能力。
[0006] 为解决上述问题，本发明首先提供了特异荧光探针在检测待测样品与GPR40结合 能力中的应用;所述GPR40为G蛋白偶联受体40;所述特异荧光探针为式（Π )所示的化合物；
[0007]
[0008] R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
[0009] 上述应用中，所述GPR40可为如下al)或a2)或a3):
[0010] al)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
[0011] a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0012] a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
[0013] 上述应用中，所述特异荧光探针具体可为式(I)所示的化合物；
[0014]
[0015] 上述应用中，所述待测样品可为化合物。
[0016] 为解决上述问题，本发明还提供了一种获得待测样品与GPR40结合能力的方法。 [0017]本发明所提供的获得待测样品与GPR40结合能力的方法，包括如下步骤:检测待测 样品与特异荧光探针竞争性结合GPR40的能力，从而获得所述待测样品与所述GPR40的结合 能力;所述GPR40为G蛋白偶联受体40;所述特异荧光探针为式（Π )所示的化合物；
[0018]
[0019] R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
[0020] 上述方法中，所述GPR40可为如下al)或a2)或a3):
[0021] al)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
[0022] a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0023] a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
[0024] 上述方法中，所述特异荧光探针具体可为式(I)所示的化合物；
[0025]
[0026] 上述方法中，所述待测样品可为化合物。
[0027]上述方法中，所述"检测待测样品与所述特异荧光探针竞争性结合GPR40的能力" 是通过将待测样品、所述特异荧光探针和表达所述GPR40的细胞共孵育并采用流式细胞仪 进行检测实现的。
[0028]上述方法中，所述"表达所述GPR40的细胞"可为瞬时表达所述GPR40的哺乳动物细 胞。所述哺乳动物细胞具体为HEK293细胞。所述"表达所述GPR40的哺乳动物细胞"具体可通 过将表达所述GPR40的质粒转染HEK293细胞实现。
[0029]所述共孵育的条件具体可为:室温孵育2min。
[0030]所述共孵育的初始时刻：所述特异荧光探针的浓度可为8 0~12 0 n m ο 1 / L (如 100nmol/L);所述待测样品的初始浓度可为0~1000nmol/L(如0nmol/L、0. lnmol/L、lnmol/ L、10nmol/L、100nmol/L或1000nmol/L);所述"表达所述GPR40的细胞"的浓度可为5 X 106~ 6Xl(y^/mL〇
[0031 ]所述"采用流式细胞仪进行检测"的具体方法如下:对完成共孵育的细胞的FITC通 路的荧光信号进行流式检测，将得到的荧光检测平均值进行直方图统计分析。所述方法中， 具体来说，每一个样品都收集至少10000个细胞采用高流速测样模式进行检测。当所述"表 达所述GPR40的细胞"为瞬时表达所述GPR40的哺乳动物细胞时，由于是瞬时转染，仅有一部 分细胞会表达GPR40，因此进行流式分析时，直方图会出现两个细胞峰，荧光强度较大的峰 为阳性表达GPR40细胞结合所述特异荧光探针产生的峰（结合峰），以此峰所占的比例表示 所述特异荧光探针与GPR40的结合量。
[0032]所述方法中，可将结合峰比例对所述待测样品的浓度作图，得到竞争曲线。
[0033] 所述方法中，可采用Origin软件对所述竞争曲线进行Sigmoidal拟合，即得到待测 样品的半抑制浓度，然后按照下述公式计算得到待测样品与GPR40的结合常数：
[0034]结合常数=半抑制浓度XA/B;
[0035]其中A为所述特异荧光探针与GPR40结合常数，B为所述特异荧光探针的浓度。
[0036] 所述特异荧光探针与GPR40结合常数具体可为100nmol/L。
[0037]待测样品与GPR40的结合常数越大，则待测样品与GPR40的结合能力越强。
[0038]所述"表达所述GPR40的质粒"可为上海吉凯基因化学技术有限公司生产的产品目 录号为P0SE141087382的质粒。
[0039]特异荧光探针在制备检测待测样品与GPR40结合能力的产品中的应用也属于本发 明的保护范围；所述GPR40为G蛋白偶联受体40;所述特异荧光探针为式（Π )所示的化合物；
[0040: 一\4 V 丄1.入，
[0041 ] R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
[0042] 上述应用中，所述GPR40可为如下al)或a2)或a3)的蛋白质：
[0043] al)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
[0044] a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0045] a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
[0046] 上述任一所述应用中，所述特异荧光探针具体可为式(I)所示的化合物；
[0047] \ X / u
[0048]本发明还保护式（Π )所示的化合物；
[0049]
[0050] R为严生荧光检测信兮的尤机基团或有机基团。
[0051 ]式（Π )所示的化合物具体可为式(I)所示的化合物；
[0052]
[0053] 实验证明，本发明提供的检测待测样品与GPR40结合能力的方法可有效检测待测 样品与GPR40的结合能力。利用本发明提供的方法检测待测样品与GPR40结合能力具有如下 优点：（1)特异荧光探针与GPR40的结合位点明确；（2)特异荧光探针与GPR40结合特异性非 常好；（3)特异荧光探针的检测为荧光检测，特异荧光探针的制备方法简单，且稳定性好、无 危害性；（4)采用流式细胞仪检测特异荧光探针与细胞表达的GPR40结合，操作简单。可见， 本发明提供的方法在检测待测样品与GPR40结合能力方面重要应用价值。
【附图说明】
[0054]图1为制备荧光探针F-TA