养殖池塘有机物质归趋特征同位素示踪方法
【技术领域】
[0001] 本发明方法技术属于生态领域，具体设及一种测定养殖池塘生态系统稳定同位素 的方法，据此分析池塘物质循环和能量流动状况。
【背景技术】
[0002] 食物网的营养结构、物质循环和能量流动是生态系统研究的重要部分，随着科学 技术的发展，研究内容的不断深入和研究结果要求的不断提高，传统的方法已不能满足要 求。自20世纪60年代W来，稳定同位素的应用研究取得突破性进展。近几年，稳定同位素技 术已作为一种重要的研究手段应用于生态学领域研究中。生物体取食来源不同的食物，经 过积累而造成了体内同位素组成差异，W此为基础的稳定同位素分析在野生动物食物资 源、栖息地选择、迁徙、生理状态评估、营养物质体内分布、水域食物网及生态系统的结构与 能量流动等研究中得到了越来越广泛的应用。
[0003] 与传统的动物食性分析方法相比较，该技术有明显的优点。不仅可对所获得的材 料再进行回顾调查分析，运是其他食性分析方法所不具有的。同时通过同位素质量平衡方 程的建立，可W对食物来源分析进行准确的定性定量计算。可根据专口的模型，对系统进行 分析。
[0004] 目前，有大量的关于稳定同位素技术在生态学领域应用的实例。比如，利用碳氮稳 定同位素技术研究水域食物网结构和营养级关系，水生动物食物转换，水生生物的徊游与 分布等，时至今日，它的功能几乎渗透到各个领域、行业，成为推动科学进步、国民经济发展 的有力工具。但是，充分、准确地利用该技术，要W合理、可靠的测量数据为前提。目前在同 位素分析前，有关样品的处理、进样操作、仪器的规范操作等步骤在各研究中存在很大的差 异，至今还没有形成与不同生物种类相对应地标准的保存和预处理方法和统一的分析模 型，对于应用该技术的研究者选着方法时有一定的困难。不同处理方法和混合模型得到的 结果也有差异，运使得稳定同位素比值在各研究间的相互比较存在很大的困难，也不便于 联合各研究中不同生物的同位素比值去构建完整的食物网模型，所W，好的稳定同位素测 量技术对数据的准确性是十分重要的。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种测定养殖池塘生态系统稳定同位素的方法，可W简便、标准化、 可靠地测量同位素。
[0006] 本发明的一个方面，提供了一种养殖池塘有机物质归趋特征同位素示踪技术，根 据稳定同位素的分馈效应，测定生物和非生物样品的稳定同位素来分析生态系统中营养物 质的流动特征，包括如下步骤：
[0007] (1)用于测定的样品的选择与预处理
[000引A、用于测定的鱼类选择背部肌肉组织做样品；
[0009] B、用于测定的带壳动物在作为被捕食者时除去外壳的部分作为样品，用于测定的 带壳动物在作为捕食者时包含外壳的整个个体都作为样品；
[0010] C、用于测定的浮游动物选择整个个体作为样品；
[0011] D、用于测定的底栖动物选择整个个体作为样品；
[0012] E、水体中的颗粒有机物(P0M)样品通过孔径0.7皿玻璃纤维滤膜过滤待测水域水 体后获得，所述玻璃纤维滤膜预先经过450-550°C灼烧4小时；
[0013] F、用于测定的陆生植物及水生植物去掉表面杂质后整个个体作为样品；
[0014] G、沉积物样品和含有无机碳酸盐的样品在离岸边1米W上的鱼类活动均匀的区域 采集获得，去除杂质后用盐酸滴加处理，直至没有气泡产生，或者采用浓盐酸熏蒸处理；
[0015] (2)干燥研磨与包样
[0016] A、干燥研磨:将获得的样品完全干燥后研磨成均匀的粉末；
[0017] B、再干燥:将获得的样品粉末在现憶前再烘2-4小时；
[0018] C、包样:将粉末状样品按测试要求的质量范围用分析天平准确称取于锡锥杯中， 选取一种样品作为内标物，每9个样品间包一个内标样，包好的样品放在相应的样品板中 (用于定时观察仪器测样时的稳定性），并记录；
[0019] (3)质谱仪的设置
[0020] A、打开质谱仪、真空累和计算机，通过计算机控制真空累调节质谱仪的真空度:调 节真空度化Vac)到e-009mBa;r;
[0021] B、打开气瓶阀口并检查气瓶的气体压力；
[0022] C、打开元素分析仪并检漏；
[0023] D、通过计算机调节炉溫及流速:左炉900°C，右炉680°C，色谱柱50°C，流速140ml/ min；
[0024] E、在溫度前方框打对勾，Set Instrument to s1:and前去掉对勾一Send一OK;
[0025] F、确认升溫及流速正常，升溫完成后，先打开真空阀，再打开离子源，待离子源稳 定lOmin后测样；
[0026] (4)将步骤(2)中包好的样品加样，测定；
[0027] (5)结果的输出与数据的处理
[0028] 根据碳氮国际标样修正结果，输出样品碳氮同位素实际值。
[0029] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤（1)中所述浓盐酸 熏蒸处理为采用浓度为12mol/L的盐酸熏蒸4小时，所述去除杂质后用盐酸滴加处理采用 Iml/L的盐酸。
[0030] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤(2)中的干燥研磨 步骤包括真空干燥、冷冻干燥或40-70°C低溫烘干。
[0031] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤(2)中的包样步骤 中称取鱼肌肉和底栖动物1.5mg左右，植物2-3mg，P0M为15mg，浮游植物15mg，沉积物15- 20mg〇
[0032] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤(3)中所述的气瓶 的气体压力分别调节为氮气0.3Mpa、二氧化碳0.3Mpa、空气0.2Mpa、氮气0.3Mpa、氧气 0.3Mpa 〇
[0033] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤(3)中还包括同位 素质谱仪精密度和准确度的验证步骤，具体包括：
[0034] A、精密度的确定:已经开好机的同位素质谱仪，先验证其精密度，通过随机选取一 种样品作为内标物，重复10~12次测定碳氮稳定同位素 δχ值，分别计算51?和δ?5Ν的标准偏 差，验证质谱仪的精密度；
[0035] Β、准确度的确定:选择标准ΤΤΒ-1的测较，通过测得的值与标准值的吻合程度判断 准确度。
[0036] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤(4)中的加样步骤 通过加样器从进样孔9〇的开始加样，加样后2min，排空空气，通过计算机选择准确的数据输 出路径后即可开始测样。
[0037] W上所述的方法，其中，根据食物网组成来确定样品种类，步骤(5)中所述的国际 标样为USGS24和USG26。
[0038] 本发明从各种稳定同位素测定方法中总结出经验，提炼出一种能准确测定养殖池 塘样品稳定同位素的方法，不仅说明了测样的具体过程，同时也指出了测定养殖池塘样品 碳氮稳定同位素过程中需要注意的问题，对容易引起同位素 S值变化的样品选择(如鱼体肌 肉选择、底栖动物的挑选和附着藻的采集等)和预处理(底栖动物清养、沉积物酸化等)等步 骤进行了科学合理的标准化处理，根据同位素在池塘生态系统中的流动的特点W及样品的 稳定性进行样品选择，保证测量结果的可靠性。
[0039] 本发明技术过程简便，易操纵执行，并且具有严格的规范性和科学性。
[0040] 本发明技术设及到了测定样品稳定同位素的样品前处理到质谱仪测定的一系列 过程，系统性高，方法全面。
【附图说明】
[0041] 图1是本发明实施例中提供的测定C、N稳定同位素的测定流程图。
[0042] 图2是本发明实施例中提供的检测仪器精密度和准确度和重复9次测定的小龙邮 C、N同位素比值图。碳稳定同位素的平均值和标准差分别为一26.609°/〇〇和0.088°/〇〇;氮稳定 同位素的平均值和标准差分别为13.855%。和0.113%〇。
[0043] 图3是本发明实施例中根据用于同位素分析的SIAR软件包作出的养殖池塘同位素 分析模型数据图，Groupl-5分别指草鱼、錦、娜、青鱼、館;另外屯种为源。
【具体实施方式】
[0044] W下结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】进行更加详细的说明，W便能 够更好地理解本发明的方案W及其各个方面的优点。然而，W下描述的【具体实施方式】和实 例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 本发明的测定稳定同位素的步骤如下：
[0048] (1)样品的选择与预处理
[0049] 在武汉新洲区域选了 3个四大家鱼混养池塘，采集了池塘中的沉积物、P0M、附着 藻、鱼背部肌肉、投喂的饲料、草料、底栖动物。
[0050]沉积物的采集:坐小船在池塘对角线的中点附近及离池岸2m左右的两侧用彼得森 采泥器采集Ξ个沉积物样品，装入标记好的封口袋中，放入保溫箱带回实验室6(TC烘箱中 烘至恒重，经研鉢粉碎后的沉积物样品用Imol/L的稀盐酸浸泡酸化，连续浸泡两Ξ次，直到 没有气泡产生。
[0051 ]水体中的颗粒有机物(PCM)的采集:GF/C玻璃纤维滤膜在450-550°C的马弗炉中灼 烧4hW去除滤膜上的有机物质，采集养殖池塘水样，预先用113皿的浮游生物网去除大型浮 游动物和藻类，然后将水样用真空抽滤装置经灼烧后的GF/C滤膜过滤，直到过滤水流非常 慢时，取出滤膜并在60°C下烘干。
[0052] 附着藻的采集：用牙刷刷取附着在池塘边缘水草、石头、竹竿等表面的附着藻，洗 入蒸馈水中，用450-550°C灼烧4h的Whatman GF/C玻璃纤维滤膜在真空抽滤机的低压下过 滤水样，滤膜在60°C下烘干。
[0053] 鱼类肌肉样的采集:从池塘采集各种喂养的成鱼，每种3-5条，装入预先放好冰块 的保溫箱中，带回实验室在解剖台上取鱼背部肌肉一小块，去掉皮，放入50ml离屯、管中60°C 烘干至恒重。
[0054] 投入品的采集:饲料和草料直接在巧料机及池塘周围采集，装入封口袋带回实验 室，60°C烘干至恒重即可。
[0055] 底栖动物的采集:在池塘对角线的中点附近及离池岸2m左右的两侧用彼得森采泥 器采集池塘表层底泥，现场用60目的筛网冲洗过滤，洗后残留物装入封口袋中，加一定量的 水带回实验室，从底泥中挑选出底栖动