一种运用高效液相色谱检测马来酸阿法替尼有关物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学技术领域，具体的说是涉及一种运用高效液相色谱检测马来 酸阿法替尼有关物质的方法。
【背景技术】
[0002] 马来酸阿法替尼是一种不可逆转的ErbB家族阻断剂，可以选择且有效的阻滞ErbB 家族受体(EGFR，HER2[ErbB2]和ErbB4)的信号传导和阻隔与癌细胞生长和分裂相关的主要 通道。用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗及HER2阳性的晚期乳腺癌患者（用于 治疗因表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者）。
[0003] 马来酸阿法替尼化学名：4_二甲氨基-丁-2(E)-烯酸[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7_ (四氢呋喃_3(S)_氧基)-喹唑啉-6-基]酰胺，二-2(Z)_ 丁烯二酸盐。CAS号为850140-73-7; 分子式为C24H25CIFN5O3 · 2C4H4O4;结构式如下：
[0005]在合成该化合物的过程中，有关键的中间体由于反应不完全而带到后续的反应 中，生成反应副产物；由于起始原料纯度不高而引入的反应副产物；由药物自身降解产生的 降解产物，都属于该药的有关物质，需要进行严格的质量控制。其中包含13个杂质，结构式 见表2:
[0006]表2马来酸阿法替尼有关物质
[0009]
[0010] 对于马来酸阿法替尼合成路线中引入的杂质及降解产物，在原料药及其制剂中都 需要进行严格的质量控制。因此，实现对马来酸阿法替尼所有潜在杂质的分离，在马来酸阿 法替尼合成工艺的过程控制，及原料药、制剂产品的质量控制中均具有非常重要的意义。
[0011] 目前，在现有的检测方法中还未有同时针对上述13种有关物质的HPLC检测手段， 仅在药学研究(Journal of Pharmaceutical Research)期刊2014年第33卷第6期中刊载一 篇"HPLC法测定阿法替尼片的含量"的文献，该文献所述方法是用于阿法替尼片含量测定， 其专属性考察项只验证了空白辅料对阿法替尼的测定无干扰，该方法无法实现对所有工艺 杂质、各降解杂质的完全分离，无法对产品质量进行有效控制。而马来酸阿法替尼有关物质 的分析检测对反应控制、收率提高和样品稳定性评价有着重要的作用，同时也直接影响着 终产品的质量，所以建立一种稳定有效的分析检测方法对马来酸阿法替尼进行质量控制是 非常有必要的。
【发明内容】
[0012] 有鉴于此，本发明的目的在于一种运用高效液相色谱检测马来酸阿法替尼有关物 质的方法，使得所述方法可以定量测定马来酸阿法替尼原料药及其制剂所有可能存在的有 关物质的含量（即表1中各杂质），从而有效控制马来酸阿法替尼及含马来酸阿法替尼制剂 产品的质量，专属性强。
[0013] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0014] -种运用高效液相色谱检测马来酸阿法替尼有关物质的方法，包括：
[0015] 将待测马来酸阿法替尼原料药或其制剂用稀释液配制成检测溶液，以十八烷基硅 烷键和硅胶为固定相，采用无机盐缓冲液为流动相A、有机相为流动相B进行梯度洗脱，在阿 法替尼吸收波长下记录HPLC谱图；其中，所述无机盐缓冲液pH值为9.8-10.2。
[0016] 针对现有检测方法无法完全分离马来酸阿法替尼13种有关物质的缺陷，本发明采 用十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱（固定相），以调节适宜pH值的无机盐缓冲液-有 机相为流动相对需要检测的马来酸阿法替尼原料药或其制剂进行检测，能够完全分离主要 和各杂质，峰型较好，符合中国药典的规定。
[0017] 其中，所述无机盐缓冲液可选择为醋酸铵缓冲液、磷酸二氢铵缓冲液、磷酸氢二铵 缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液或磷酸氢二钾缓冲液。进一步优选地，所述无机盐缓冲液中无机 盐的浓度为〇. 〇〇2moL/L~0.02moL/L，在该浓度范围内，无机盐的浓度可以为0.002moL/L、 0·005moL/L、0·01moL/L或0·02moL/L。
[0018] 作为优选，所述有机相为甲醇或乙腈。
[0019] 作为优选，所述无机盐缓冲液pH值为10.0。除此之外，本发明所述无机盐缓冲液pH 值在9.8-10.2范围内还可选择为9.8、9.9、10.1或10.2。
[0020]本发明所述梯度洗脱可按照常规的洗脱模式进行洗脱，对此本发明提供了较优的 洗脱方式，所述梯度洗脱按照表1进行：
[0021 ]表1梯度洗脱
[0023] 作为优选，所述十八烷基硅烷键和硅胶为Waters XBridge C18,进一步优选地，所 述Waters XBridge C18规格为4.6X250mm，3.5ym。
[0024] 作为优选，所述阿法替尼的吸收波长为254nm。
[0025] 作为优选，所述稀释液为甲醇。
[0026]作为优选，所述梯度洗脱的流速为0.5mL/min，所述固定相的柱温为40°C，所述检 测时的进样量为l〇yL，所述检测溶液中阿法替尼的浓度为0.5mg/mL。所述流速、柱温、进样 量以及检测溶液中阿法替尼的含量等参数可根据实际检测中的情况进行调节，本发明所提 供的优选值为参考值。
[0027] 为了验证本发明能够全部分离出13种有关物质，本发明分别通过系统适应性试验 以及阿法替尼与其杂质混合溶液的验证试验来证明，在系统适应性试验中，取马来酸阿法 替尼、杂质I、SMI、CL-SM1、M、D储备液适量配制成系统适应性溶液，按照本发明提供的检测 方法进行HPLC检测，结果显示，保留时间为47.432min的色谱峰为阿法替尼色谱峰，图中各 色谱峰依次为马来酸、杂质I、杂质M、杂质CL-SM1、阿法替尼、SM1(起始原料）、杂质D，系统适 用性溶液中阿法替尼与马来酸及其余5个杂质均能达到良好的分离，符合中国药典的要求。 而在阿法替尼与其杂质混合溶液的验证试验中，分别量取马来酸阿法替尼、杂质A、B、E、F、 G、H、J、L、M、SM1、CL-SM1、I配制成阿法替尼与其杂质混合溶液，按照本发明提供的检测方法 进行HPLC检测，检测结果显示，保留时间为47.711min的色谱峰为阿法替尼色谱峰，其余各 峰为阿法替尼12个杂质的色谱峰，图中各色谱峰依次为杂质J、杂质L、杂质I、杂质M、杂质 CL-SM1、杂质B、杂质F、阿法替尼、SM1(起始原料）、杂质G、杂质E、杂质H、杂质A，混合溶液中 阿法替尼与其各杂质均能达到良好的分离，符合中国药典的要求。
[0028] 同时，本发明还分别以马来酸阿法替尼原料药以及制剂进行检测，结果显示，阿法 替尼的化学纯度可以达到原料药的要求，本法可用于马来酸阿法替尼原料药的质量监测， 同时制剂中的辅料成分不干扰检测的进行，可以用于马来酸阿法替尼制剂的质量监测。 [0029]此外，作为对比，本发明按照文献"HPLC法测定阿法替尼片的含量"中记载的HPLC 条件进行检测，以包含了马来酸、杂质4、8、04、？、6、^丄、1、311、1的混合溶液为样本，结 果显示，马来酸与杂质J，杂质L与杂质M，杂质D与杂质I在此文献方法条件下，均无法实现分 离。
[0030] 由以上技术方案可知，本发明方法采用十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱， 以调节适宜pH值的无机盐缓冲液-有机相为流动相，可以定量测定马来酸阿法替尼及其制 剂所有可能存在的有关物质的含量，能够完全分离主要和各杂质，峰型较好，符合中国药典 的规定，有效控制马来酸阿法替尼及含马来酸阿法替尼制剂产品的质量，本发明方法专属 性强、分离度高，灵敏度高，准确度良好。
【附图说明】
[0031] 图1所示为按照本发明方法检测系统适用性溶液的HPLC图谱；
[0032] 图2所示为按照本发明方法检测阿法替尼与其杂质混合溶液的HPLC图谱；
[0033]图3所示为按照本发明方法检测空白溶剂的HPLC图谱；
[0034]图4所示为按照本发明方法检测马来酸阿法替尼原料药HPLC图谱；
[0035]图5所示为按照本发明方法检测马来酸阿法替尼制剂HPLC图谱；
[0036]图6所示为按照本发明方法检测马来酸阿法替尼制剂空白辅料HPLC图谱；
[0037 ]图7所示为按照现有文献方法检测马来酸、杂质4、8、04、？、6、^^、311、1组成 的混合溶液的HPLC图谱；
[0038] 图8所示为按照现有文献方法检测阿法替尼、杂质I、杂质G组成的系统适用性溶液 的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0039] 本发明实施例公开了一种运用高效液相色谱检测马来酸阿法替尼有关物质的方 法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本 发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神 和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技 术。
[0040] 在采用HPLC进行有关物质检测前，都会进行系统适应性检测，确认检测体系能够 满足检测的要求(一般在这里是主峰与杂质的分离度或某些杂质间的分离度要求）。在具体 实施方式中，本发明已经验证系统适用性溶液中阿法替尼与马来酸及其余5个杂质均能达 到良好的分离，并且在验证试验中进一步证明了能够分离所有有关物质，符合中国药典的 要求。
[0041] 在【具体实施方式】中，所用各试剂、药品、试验环境等在未经特殊说明下，均来源相 同和一致。
[0042] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种运用高效液相色谱 检测马来酸阿法替尼有关物质的方法进行详细说明。
[0043]实施例1:系统适用性检测
[0044] 仪器:岛津LC-20A高效液相色谱仪及其工作站VWD(或PDA)检测器；
[0045] 色谱柱：Waters XBridge C184.6X250mm，3.5ym;
[0046] 流动相A:0.002mol/L磷酸氢二钾缓冲液(用2mol/L氢氧化钠调pH至10.0);
[0047] 流动相B:乙腈；
[0048] 检测波长：254nm;
[0049] 流速:0.5mL/min;
[0050] 进样量：10yL;
[0051] 柱温：40 °C;
[0052] 梯度洗脱表:见表1;
[0053] 稀释液：甲醇；
[0054] 取马来酸阿法替尼适量（约相当于阿法替尼25mg)，置50ml量瓶中，分别量取杂质 I、SMI、CL-SM1、M、D储备液适量，用甲醇溶解并稀释制成含马来酸、阿法替尼、杂质I、SM1、 CL-SM1、M、D浓度分别为0 · 24mg/ml、0 · 5mg/ml、5ug/ml、0 · 75ug/ml、0 · 75ug/ml、0 · 75ug/ml、 0.5ug/m 1的混合溶液