一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及生物工程领域，更具体的说，是涉及一种猪瘟病毒E2抗原及其猪瘟病 毒胶体金检测试纸条的制备。
【背景技术】
[0003] 猪瘟是一种急性、热性、高度接触性的传染病，主要症状是高温、微血管变性而引 起全身出血、坏死、梗塞，其高度的发病率和死亡率给世界各国的养猪业造成了巨大的经济 损失。我国也是猪瘟流行较严重的国家，每年因猪瘟死亡的猪占饲养总数的3°Ρ5%，造成了 巨大的经济损失。由于它造成的经济损失惨重，所以兽医工作者一直在致力于猪瘟防制的 研究。因此长期以来，猪瘟一直是疫病研究中的重点和热点。
[0004] 自80年代以后，随着单克隆抗体和现代生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们 相继研制了多种猪瘟病毒（CSFV)单抗，鉴定了 CSFV的中和抗原表位，尤其是测定了 CSFV 不同毒株的基因组全序列，从而有可能在分子水平上阐明CSFV本身的一些生物学特性以 及猪瘟发生的分子机制。随着现代生物技术的发展，虽然猪瘟在其病原特性的分子生物学 研究等方面已取得了很大进展，但仍有许多问题亟待解决。
[0005] 在我国，由于C-株疫苗的长期使用，有效控制了猪瘟的急性发作和大流行。近年 来猪瘟的发生又呈上升趋势，表现更加复杂，既有区域性大流行，又有零星散发；既有高死 亡率的急性症状，又有持续感染的温和性症状。许多猪场的免疫猪群频繁发病，甚至将疫苗 剂量加大数倍或数十倍，疫情依然不能控制，有些猪还因注射疫苗而引发猪瘟造成死亡，因 此根除猪瘟是一项艰巨而长期的工作，对流行毒株的致病性和核酸序列进行分析研究，了 解猪瘟病毒疫苗毒株与流行毒株之间的差异以及流行毒株的变异情况和致病特点，对于防 制猪瘟是十分必要的。
[0006] 随着基因组学的不断发展，CSFV基因组结构及其编码的蛋白已被人们进一步认识 和了解。在病毒基因组所编码的蛋白中，E2是3种囊膜糖蛋白中最重要的保护性抗原，产 生CSFV主要结构蛋白；而且E2基因也是猪瘟病毒中最易突变的基因，所以国内外对猪瘟 的研究多集中在E2基因，E2蛋白是CSFV新型诊断抗原的首选蛋白。
[0007] 本发明对国内外CSFV E2基因编码的抗原结构研究的基础上，通过已发表的不同 病毒株E2基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简并 引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化。抗原通过胶体金试纸条包 被基因重组的E2对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清都能进行特异、灵敏的检测，为猪瘟 病毒的大批量现场检测，流行病学调查具有重要的意义；同时有效地促进猪重大疫病的监 测与净化工作，对提高我国养猪业生产的整体技术水平和公共卫生安全，发挥巨大经济与 社会效益。
【发明内容】
[0008] 发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供方便、快捷的用 于检测及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条，检测猪全血、血浆或者血清标本中猪瘟病毒抗体， 用于猪瘟病的辅助治疗。
[0009] 本发明的另一目的是提供上述试纸条的制备方法。
[0010] 技术方案：本发明提供的一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其包括：同时包 被猪瘟病毒E2蛋白、合成多肽及特定多肽三条带的硝酸纤维膜，含有胶体金标记的猪蓝耳 病毒N蛋白的玻璃纤维膜。
[0011] 其中，所述猪瘟病毒E2蛋白为在对猪瘟病毒E2基因编码的抗原结构研究的基础 上，通过对已发表的不同病毒株E2基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结 构的差异；同时通过简并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化，再 经杆状病毒表达载体表达制备获得。
[0012] 作为优选，所述硝酸纤维膜中，猪瘟病毒E2蛋白的浓度为0. 15±0. 01mg/ml，合成 多肽的浓度为2· 0±0· 1 mg/ml。
[0013] 作为另一种优选，所述玻璃纤维膜中，胶体标记的猪瘟病毒E2蛋白的pH值为 5. 0~5. 4,胶体金和猪蓝耳N蛋白的配比为以36 μ g蛋白/ml胶体金。
[0014] 作为另一种优选，还包括反应支持物（13)、免疫胶体金金标垫（12)和吸水垫 (11)，所述反应支持物（13)上依次相互搭接粘贴的免疫胶体金金标垫（12)、硝酸纤维膜 (10)和吸水垫（11)。
[0015] 作为进一步优选，所述反应支持物（13)为PVC板；吸水垫（11)为滤纸；免疫胶体 金金标垫（12)为聚酯膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
[0016] 本发明还提供了上述猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤： 1) 通过对不同病毒株E2基因序列比较，找出各毒株之间主要抗原结构的差异； 2) 通过简并引物对E2蛋白进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化； 3) 硝酸纤维膜的制备：将E2蛋白稀释成0. 15±0.01 mg/ml，将合成多肽的浓度稀释成 2. 0±0. 1 mg/ml和0. 2±0. 01 mg/ml喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线、对照线和质检 线，且在37°C中干燥2小时，备用； 4) 玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整pH值为5. 0~5. 4,胶体金和猪瘟病毒E2的配 比为以36 μ g/ml胶体金，经稳定剂(含0. 05% BSA，PH8. 0, 0.0 lMTris缓冲液)处理后，按每 平方厘米65 μ 1的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用； 5) 在反应支持物上依次相互搭接粘贴免疫胶体金金标垫（12)、硝酸纤维膜和吸水垫， 即得。
[0017] 其中，所述简并引物为：
[0018] 本发明还提供了上述猪瘟病毒胶体金检测试纸条在猪瘟病毒中检测的应用。
[0019] 有益效果：本发明提供的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定 性半定量对全国不同猪痕病毒株免疫的猪血清能进行特异、灵敏的检测，达到快速筛检病 猪，及时控制疫情的目的。方便、快速、简捷，节省了大量的人力物力，不需要特殊仪器设备， 不需要专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量 现场检测，适合流行病学调查，对猪瘟病毒的感染诊断起到辅助治疗作用。
[0020] 本发明在对猪瘟病毒E2基因编码的抗原结构研究的基础上，通过对已发表的不 同病毒株E2基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简 并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化。抗原通过胶体金试纸条 包被基因重组的E2对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清能进行特异、灵敏的检测，对猪瘟 病毒的感染诊断起到辅助作用。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明所述猪瘟病毒抗体检测试纸条的主视图； 图2为本发明所述猪瘟病毒抗体检测试纸条的右视图； 其中卡体；2检测窗孔；3加样孔；4透气孔；5质控线C1 ;6猪瘟病毒重组蛋白的判 断线T ; 7指示体内抗体是否具有保护作用的指示线C2 ;8样品垫；9滤血膜；10硝酸纤维 素膜（Cl，T，C2) ;11吸水垫；12免疫胶体金金标垫；13反应支持物。
[0022] 图3为检测试纸条检测结果示意图。从左至右依次为：T、Cl、C2三条线阳性；C1 和C2两条线阴性、C1 一条线阴性阴性，无效。
[0023] 图4为限制性内切酶BamHI和Xhol分别双酶切质粒pFastBac载体和PCR扩增产 物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0024] 图5为质粒DNA测序图： 图6为猪痕病毒遗传发生树。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制发明的范围；若未特别指明，实施例中 所用的技术手段为本领域技术人员说熟知的常规手段。
[0026] 实施例1猪瘟病毒E2蛋白的克隆及表达 (1)目的基因的获得 利用国际互联网（Internet)调出了猪瘟病毒基因库（GenBank)中库存的14个国外猪 瘟病毒的E2基因序列，加上国内所测的E2基因序列，利用计算机专用软件完成了猪瘟 病毒遗传发生树的绘制。
[0027] 对E2基因的蛋白质序列和基因序列进行比对，根据比对结果及本发明对国内外 CSFV E2基因编码的抗原结构研究基础上，通过简并引物对E2进行PCR。
[0028] 其中，简并引物为：
[0029] 扩增出目的片段N，扩增条件：94 °C变性3 min，94 °C 45 S，56 °C复性90 S， 72°C延伸80 S，进行30个循环，最后72 °C延伸10 min。
[0030] (2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选 使用限制性内切酶BamHI和Xhol分别双酶切质粒pFastBac载体和PCR扩增产物，琼脂 糖凝胶电泳后（图4)，切取含有目的片段的凝胶，使用TaKaRa试剂盒回收并纯化目的片段。 使用T4 DNA Ligase将回收的载体片段和插入片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感 受态细胞。从平板上挑取单菌落，摇菌提取质粒DNA，酶切鉴定正确的质粒送测序进一步验 证，测序图见图5。
[0031] (3)重组转移质粒转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞 大肠杆菌DHlOBac含有卡那霉素抗性的杆粒bM0N14272和四环素抗性的辅助质粒 PM0N7124,因此在培养过程中需要加入终浓度为50 μ g/mL的卡那霉素和10 μ g/mL的四环 素。其感受态细胞的制备方法与前述大肠杆菌感受态细胞的制备方法相同。
[0032] 在重组转移质粒转化DHlOBac感受态细胞时，通过位点特异性转座作用，转移载 体上的外源基因插入到bacmid的革E位点上，从而形成重组bacmid。转化操作如下：从-70°C 取出DHlOBac感受态细胞，冰上解冻后，加入1 μ L重组转移质粒，轻轻吹打混匀。将混合物 置冰浴30min，42°C水浴热击45s，立即冰浴2min，加入900 μ L LB液体培养基，37°C，225 rpm振荡培养4 h。取培养物用新鲜的LB液体培养基稀释100倍后，吸取100 μ L涂布LB 三抗平板(含50 μ g/mL卡那霉素，7 μ g/mL庆大霉素，10 μ g/mL四环素，40 μ g/mL IPTG， 100 μ g/mL X-gal)，37 °C倒置培养4