一种肾癌患者外周血vegf的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测VEGF的新方法，尤其是通过外周血检测肾癌患者VEGF的方 法。
【背景技术】
[0002]在肾癌的发生发展中，缺氧诱导信号通路发挥着重要的作用，其信号的改变可以 影响下游的VEGF通路，促进肿瘤血管生成，进而引起肿瘤进展。因此VEGF不但可作为预后判 断的指标，也成为了肿瘤治疗的新靶点。研究表明，VEGF可作为肾癌分期、分级及预后判断 的指标，为肾癌术后靶向药物或细胞因子辅助治疗提供依据，目前，针对VEGF及其相关受体 的靶向药物，如索拉非尼、苹果酸舒尼替尼等，已成为晚期肾癌的一线治疗用药。因此，正确 检测肾癌患者的VEGF表达情况至关重要。
[0003]目前通常使用的VEGF检测方法有两种。一种是免疫组织化学方法，通过检测肾癌 组织标本中的VEGF相关蛋白表达情况判定VEGF状态。另外一种方法是蛋白免疫印迹法 (Western blot)，特异性更高，目前临床应用亦越来越多。这两种检测方法均是以肾癌组织 为检测对象，尤其适用于肾癌行手术切除治疗的患者。但对于部分缺乏手术指征或存在手 术禁忌症的肾癌患者（如晚期肾癌患者），由于肿瘤组织无法切除，细针穿刺组织又容易造 成肿瘤播散，VEGF表达状态的评估变得困难。
【发明内容】
[0004] 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落进入外周血液 循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检 测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的 个体化治疗具有重要的临床意义。因 CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的"液 态活检"。
[0005] 为了克服晚期肾癌患者不适宜组织标本取材，进而无法评估患者VEGF表达状态的 不足，本发明提供了一种肾癌患者外周血VEGF的检测方法:利用膜过滤装置分离获取晚期 肾癌患者外周血中的CTC;运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测肾癌患者VEGF基因表 达情况。
[0006] 本发明采用的技术方案如下：
[0007] -、利用膜过滤装置分离获取晚期肾癌患者外周血中的CTC:
[0008] 1、采集晚期肾癌患者外周血:肘正中静脉5ml;
[0009] 2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：lmmol/1 EDTA+ 0.1%BSA，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%;
[0010] 3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞： 将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过 滤；
[0011] 4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液 加入到滤器中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微 镜下观察，确定CTC是否存在。
[0012] 二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
[0013] 1、脱色:将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC 染色液，所述脱色液为:95 %酒精与100 %二甲苯按体积比1:1混匀。
[0014] 2、包裹:浸泡结束后取出滤膜，用用吸水纸包裹；
[0015] 3、固定:将包裹物置于10%中性福尔马林中，固定4_6h;
[0016] 4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细 胞石蜡块；
[0017] 5、薄层切片:用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μπι的薄层切片。
[0018] 三、检测肾癌患者VEGF基因表达情况：
[0019] 1、将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化:二甲苯溶液浸泡3 次，每次10分钟;无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟;95 %乙醇溶液浸泡5分钟;85 %乙醇溶 液浸泡5分钟；75 %乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟;PBS(PH= 7.4)浸泡3 次，每次3分钟；
[0020] 2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复:取pH = 6.0柠檬 酸盐缓冲液800_1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐 高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分 钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH = 7.2-7.4 的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
[0021] 3、3%H2〇2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次2分 钟；
[0022] 4、滴加 VEGF-抗，室温或37°C孵育1-2小时或4°C过夜，PBS冲洗3次，每次2分钟；
[0023] 5、滴加通用型IgG抗体，室温或37°C孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
[0024] 6、应用DAB溶液显色：甩去roS液，每张切片加2滴或100μΙ新鲜配制的DAB溶液，显 微镜下观察3-10分钟；
[0025] 7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片:蒸馏水冲洗2次，每次3分钟;苏木素复染1分 钟;0.1 %盐酸酒精分化;0.1 %氨水返蓝；100 %、95 %、90 %梯度乙醇脱水干燥;二甲苯透 明，中性树脂胶封片；
[0026] 8、细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定VEGF表达情况。
[0027] 步骤中所述的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台， 所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的 下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。
[0028] 所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上； 滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。
[0029] 所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔。肿瘤细胞直径一 般大于15微米，而血细胞(包括红细胞、白细胞)直径一般小于10微米，因此当含有CTC的外 周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔被截留在滤膜 上。
[0030]本发明的有益效果是:通过该技术方法，不用取材肾癌组织即可检测到肾癌患者 VEGF表达情况。该技术属于微创甚至无创，并能够实时检测。
【附图说明】
[0031 ]图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；
[0032] 图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；
[0033] 图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；
[0034] 图4为晚期肾癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；
[0035] 图5为晚期肾癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF免疫组化染色图像。
[0036] 图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜 平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0038] 运用此技术方法分离获取并鉴定8例晚期肾癌患者（同时检测8例正常人样本做阴 性对照)外周血循环肿瘤细胞VEGF基因表达情况的实施例。
[0039] 采集各样本外周血5ml，用45ml稀释液（成分：lmmol/l EDTA+0.1%BSA)稀释外周 血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟。在固定的间期，组装膜过滤装 置:如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成。
[0040] 利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：用lOmlPBS润湿滤器3， 然后将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，CTC 被截留在滤膜7上。过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口 6，将循环肿 瘤细胞Diff染色液加入到滤器3中，染色SmiruPBS缓冲液将滤器3冲洗干净