一组活动性结核病诊断标志物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一组活动性结核病诊断标志物及其用途。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，被列为我国重大传染病之一。目前 结核分枝杆菌感染人群基数大，发病率高，至今尚无有效的快速血清学诊断方法，给结核病 防治工作带来了严峻挑战。因此，在结核病疫情控制面临严峻挑战的今天，筛选结核病新型 生物标志候选物，寻求一种新的诊断技术、新药和新疫苗的开发已迫在眉睫。
[0003] 结核病的早发现、早诊断、早治疗能够提高患者治愈率，减少传染源，较好地控制 结核分枝杆菌的传播与扩散，从而降低结核病对社会及国家产生的危害。目前诊断结核病 常用的方法有：1、痰涂片抗酸染色检查:对诊断结核病具有重要临床价值，但阳性率仅达 30%左右，且不能区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染;2、传统培养法:操作繁琐且耗 时长，从临床标本分离出结核分枝杆菌的时间通常2 6周，不利于疾病的早发现及诊断；3、 自动化快速培养法:快速(1~2周）、可靠、安全，但是需要昂贵的仪器设备;4、聚合酶链式反 应-单链构想多态性分析法(PCR-SSCP法）：其影响因素较多(DNA片段长度、凝胶浓度等），可 重复性较差，在临床工作中未得到广泛应用;5、RT-PCR法:对检测条件要求高，限制其推广； 6、寡核苷酸探针杂交法:是检测结核分枝杆菌的一种快速方法，但存在一定假阴性率和假 阳性率，且试剂价格相对昂贵，未得到临床推广;7、基因芯片法:具有时限短、所需样本少、 热循环和冷却效率高等优点，但因分析软件要求高，芯片的制作成本高等缺点限制其应用； 8、GeneXp ert MTB/RIF对肺结核痰涂阴病人及耐利福平结核菌的检测可以在2小时内完成， 为肺结核快速诊断提供便利，但在经济欠发达国家和地区，应用仍受限制。肺外结核病的诊 断方法更为有限。早期检测方法滞后阻碍活动期结核病患者的及时诊治，不利于挽救病人 的生命及结核病传染源的控制。临床上急需高效、价廉、易于推广的实验室检测方法，以评 估疾病状态是否活动并可作为新型抗结核药物试验终点参考。目前结核分枝杆菌感染宿主 后血液免疫学标志物筛选国内外进行了多方位研究，部分商业试剂已用于结核病检测，但 均未获得WHO结核专家组认可大范围运用，关于活动性结核病新型生物标志候选物的筛选 与鉴定尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一组活动性结核病诊断标志物 及其用途，该组结核病诊断标志物来自结核分枝杆菌的15个抗原，判断被检人是否为活动 结核病，检测结果表明，本发明提供的蛋白质组合诊断活动性结核病的最佳工作点的特异 性为90.3 %，灵敏度为85.4%，均高于现有技术中活动结核病诊断的指标，且本技术为血清 学检测，标本容易获取，适用于各种可疑活动性结核病，包括活动性肺结核和肺外结核的诊 断。
[0005] 其具体技术方案为：
[0006] 一组活动性结核病诊断标志物，包括抗MT1560IgG抗体、抗Rv0049IgM抗体、抗 Rv0270IgM 抗体、抗 Rv0350IgG 抗体、抗 Rv0350IgM 抗体、抗 Rv0494IgM 抗体、抗 Rvl597IgM 抗 体、抗Rv2450cIgM 抗体、抗Rv2511 IgG 抗体、抗Rv2688cIgM 抗体、抗Rv3480cIgM 抗体，抗 Rvl860IgG抗体、抗Rvl876IgM抗体、抗Rv2031cIgG抗体和抗Rv2352cIgM抗体，其序列对应 SEQ：ID：N0：l-SEQ：ID：N0：15〇
[0007] 本发明所述活动性结核病诊断标志物在筛选活动性结核病诊断产品中的用途。
[0008] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0009] 本发明通过商品化MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片筛选活动性结核病诊断 分子标志物，该芯片涵盖>95%的编码基因，包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白。临床血清 样本包括正常对照组、潜伏感染组以及活动性肺结核组，分别独立地与芯片反应，以检测实 验组中针对某一种或几种抗原蛋白，具有普遍性的特异性的抗结核抗体（IgG或IgM)。基于 初筛结果，选择差异较为明显的94个结核分枝杆菌蛋白质及本研究团队既通过双向凝胶电 泳技术分离获得的6个结核分枝杆菌差异表达蛋白质，自制含100个差异表达蛋白质小芯 片，送公司点片，每个蛋白重复两点点制，进行200余份血清样本的临床验证，最终获得15个 诊断活动性肺结核的候选标志物（MT1560IgG，Rv0049IgM，Rv0270IgM，Rv0350IgG， Rv0350IgM，Rv0494IgM，Rvl597IgM，Rvl860IgG，Rvl876IgM，Rv2031cIgG，Rv2352cIgM， 1^2450(31 8]\1，1^2511186，1^2688(318]\1和1^3480(318]\〇。联合分析这15个蛋白质相应抗体的检 测结果，判断被检人是否为活动性结核病，结果表明，本发明提供小芯片辅助诊断活动性肺 结核的最佳工作点的特异性为90.3%，灵敏度为85.4%，均高于现有技术中活动性结核病 诊断的指标。
【附图说明】
[0010]图1为基于MtbProtTM蛋白质芯片的活动性结核病诊断标志物的发现与筛选流程 示意图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0012] 一、血清诊断标志物的发现与验证
[0013 ]( - )基于MtbPr 01TM蛋白质芯片的结核病诊断标志物的发现与筛选：
[0014] 1.检测原理:购买博柳生物公司MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片，该芯片包 含4262个结核分枝杆菌重组蛋白，涵盖>95%的编码基因。临床血清样本包括正常对照组、 结核潜伏感染组、以及活动性结核病组，分别独立地与芯片反应，以检测实验组中针对某一 种或几种抗原蛋白，具有普遍性的特异性的抗结核抗体（IgG或IgM)，这些抗原蛋白可以作 为诊断标志物来表征疾病状态。
[0015] 2.实验操作人：由芯片服务组生产人员执行操作。
[0016] 3.流程图如图1所示。
[0017] 4.实验操作步骤：
[0018] 1)预封闭：使用芯片孵育盒(广州柳博公司自制），加入5ml封闭液，将待质控芯片 从-80°C取出，正面朝上置于孵育盒中；再横向放在侧摆摇床（国产）上，50-60rpm，室温， 10min〇
[0019] 2)封闭：倒弃封闭液，迅速加入5ml新的封闭液，侧摆摇床20-30rpm，室温lh。
[0020] 3)血清样本孵育：倒弃封闭液，迅速加入预先准备好的蛋白样本孵育液3ml，侧摆 摇床20-30rpm，室温3h。蛋白样本孵育液:3ml孵育液加入30μ1血清(新鲜制备或冻存于-80 度，由专利申请人提供）。
[0021 ] 4)清洗:将芯片取出，置于加入有40ml清洗液的芯片清洗盒，剧烈晃动10-15次，并 更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次，充分去除游离一抗;再次更换清洗液，至于水平摇床 上，60_70rpm，5min每次，清洗3次。
[0022] 5)二抗孵育：倒弃清洗液，迅速加入预先准备好的二抗孵育液3ml，侧摆摇床20- 30rpm，避光，室温45min。二抗孵育液:使用anti-human IgG焚光二抗(549anti-人IgG，激发 光532nm，或635anti_人IgM，激发光635nm，Jackson ImmunoResearch)，孵育液稀释抗体至 其工作液浓度，总体积为3ml。二抗孵育时避光。
[0023] 6)清洗:同步骤"4"。注意该过程应避光操作。
[0024] 7)完成后用ddH20清洗5min X 2次，并冲洗10s。注意该过程应避光操作。
[0025] 8)干燥