一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和家畜疫病诊断领域，具体涉及一种猪癌抗体检测系统及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪癌是由猪癌病毒（Classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触 性病毒传染病，传播快、流行广、发病率和死亡率高，对我国养猪业危害极大。根据临床症状 和病程长短可将猪癌分为急性型、慢性型、温和型。病猪和带毒母猪是猪癌病毒的主要传染 源。世界动物卫生组织将其列为A类疾病，中国《动物防疫法》将其列为一类疫病。
[0003] 猪癌病毒属黄病毒科癌病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组大小约为12. 3肺，含 有一个大的开放阅读框（ORF)，编码一个多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞的酶作 用，形成4个成熟的结构蛋白（C、Erns、El、E2)和至少7个非结构蛋白（化ro、P7、NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。
[0004] 酶联免疫吸附试验巧nzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)因为其操作简 便，快速敏感的优点，广泛应用于市场上的猪癌抗体监测方法。目前，市场上的猪癌抗体诊 断化ISA试剂盒大多数是检测猪血清中的E2蛋白抗体，而化ns蛋白作为包被原，仅用于鉴 别诊断亚单位疫苗免疫后疫苗产生的抗体和野毒感染产生的抗体，且特异性和灵敏度均不 理想。此类E2蛋白抗体检测化ISA试剂盒针对猪癌大规模的群体诊断中，能够发挥有效的 作用。
[0005] 但是对于一些早期感染或者猪癌抗体水平低下的临床样本，单纯检测E2蛋白抗 体，有出现假阴性的可能。因此，建立一种准确可靠的新型化ISA检测手段，用来弥补现有 技术中单纯检测E2蛋白抗体的不足，对疾病的预防和控制有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪癌抗体检测化ISA试剂盒，W及 该试剂盒的制备与使用方法。
[0007] 本发明的第一方面是一种猪癌抗体检测系统，所述系统包被抗原为猪癌病毒E2 蛋白、Erns蛋白。
[0008] 术语"猪癌病毒E2蛋白"位于病毒囊膜表面，由373个氨基酸组成，是猪癌病 毒主要保护性抗原，是抗猪癌病毒感染的主要保护性抗原（李竊，王宇飞，王燈等.表 达猪癌病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析.生物化学与生物物理进 展，2009, 36(7) :916-922)。
[0009] 术语"猪癌病毒化ns蛋白"为病毒的囊膜糖蛋白，由227个氨基酸组成，无跨 膜区（高华峰，李富祥，张念祖等.猪癌病毒化ns基因的克隆及原核表达.动物医学进 展，2007, 28 (2) :22-24)。
[0010] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统中，所述猪癌病 毒E2蛋白为实质上编码序列SEQ ID No. 2的蛋白，所述化ns蛋白为实质上编码序列SEQ ID No. 4编码的蛋白。
[0011] 术语"实质上编码"意指通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸后仍然保持原有 蛋白相同或相近功能。
[0012] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统中，所述猪癌病 毒E2蛋白含量为100-400ng，化ns蛋白含量为25-lOOng。
[0013] 作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统中，所述猪癌 病毒E2蛋白含量为2(K)ng，化ns蛋白含量为50ng。
[0014] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统中，所述猪癌病 毒E2蛋白和化ns蛋白为真核表达体系表达的重组蛋白。
[0015] 作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统中，所述猪癌 病毒E2蛋白和化ns蛋白为重组杆状病毒表达体系表达的重组蛋白。
[0016] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统中，所述的检测 系统包括化ISA检测试剂盒、试纸。
[0017] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体化ISA检测试剂盒中，试 剂盒包括包被所述猪癌病毒E2蛋白和化ns蛋白的酶标板、样品稀释液、洗涂液、封闭液、带 标记的二抗、显色液、显色液、终止液、阳性猪血清对照W及阴性猪血清对照。
[001引作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体化ISA检测试剂盒中，所 述样品稀释液为含有0. 05% V/VTween-20和10% V/V脱脂奶的磯酸盐缓冲液；
[0019] 所述洗涂液为含有0. 05 % V/VTween-20的磯酸盐缓冲液；
[0020] 所述封闭液为1 % W/VBSA的磯酸盐缓冲液、5% W/V脱脂奶粉的磯酸盐缓冲液、 1. 5 % V/V明胶的磯酸盐缓冲液或5 % V/V辕牛血清FCS的磯酸盐缓冲液中的任一种；
[0021] 所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB20mg、无水己醇 IOml,并用d地2〇定容至100mL ;所述显色液B含巧樣酸2. Ig、无水胞2册〇42. 82g、0. 75% W/ V的过氧化氨尿素0. 64ml，并用d地2〇定容至100mL ;
[0022] 所述终止液为2M的H2SO4。
[0023] 术语"磯酸盐缓冲液"是指含有磯酸或其盐并被调至理想抑值的溶液，是生物化 学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磯酸盐缓冲液是从磯酸或磯酸盐（包括但 不限于钢和钟盐）制备的。本领域已经知道一些磯酸盐，例如磯酸二氨钢和磯酸二氨钟、磯 酸氨二钢和磯酸氨二钟、磯酸钢和磯酸钟。已经知道磯酸盐是W盐的水合物形式存在的。由 于缓冲液的二级解离作化缓冲的抑值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围， 更有选约6-8的范围，最优选约7. 4。进一步优选地，所述磯酸盐缓冲液为含氯化钢和氯化 钟的磯酸盐缓冲液。
[0024] 本发明的另一方面是一种所述猪癌抗体检测系统的制备方法，所述制备方法包括 W下步骤；（1)克隆表达所述猪癌病毒抗原性蛋白E2蛋白、Erns蛋白，使用所述E2蛋白和 化ns蛋白包被酶标板；（2)制备或配制样品稀释液、洗涂液、封闭液、HRP标记的兔抗猪IgG、 显色液A液、显色液B液、终止液、阳性猪血清对照W及阴性猪血清对照；W及（3)将步骤 (1)与（2)所制备的各成分组装成试剂盒。
[0025] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统的制备方法中， 所述步骤（I)中克隆表达E2蛋白为实质上编码序列SEQ ID No. 2的蛋白，所述化ns蛋白 为实质上编码序列SEQ ID No. 4编码的蛋白；所述E2蛋白含量为100-40化g/孔，化ns蛋 白含量为25-lOOng/孔；优选地，所述猪癌病毒E2蛋白含量为20化g/孔，Erns蛋白含量为 5化g/孔。作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统的制备方法中， 所述步骤（1)使用真核表达体系表达猪癌病毒E2蛋白和化ns蛋白；优选地，所述真核表达 体系为重组杆状病毒表达体系。
[0026] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪癌抗体检测系统的制备方法中， 所述样品稀释液为含有0. 05% V/VTween-20和10% V/V脱脂奶的磯酸盐缓冲液；
[0027] 所述洗涂液为含有0. 05 % V/VTween-20的磯酸盐缓冲液；
[0028] 所述封闭液为1% W/VBSA的磯酸盐缓冲液、5% W/V脱脂奶粉的磯酸盐缓冲液、 1. 5 % V/V明胶的磯酸盐缓冲液或5 % V/V辕牛血清FCS的磯酸盐缓冲液中的任一种；
[0029] 所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB20mg、无水己醇 IOml,并用d地2〇定容至100mL ;所述显色液B含巧樣酸2. Ig、无水胞2册〇42. 82g、0. 75% W/ V的过氧化氨尿素0. 64ml，并用d地2〇定容至100mL ;
[0030] 所述终止液为2M的H2SO4。
[0031] 本发明的另一方面是所述试剂盒的使用方法，作为使用方法的一种优选实施方 式，所述使用方法包括W下步骤：
[0032] (1)将待检血清和阴阳性猪血清用稀释液做100倍稀释。
[003引 似将稀释后的样品100 加入至ELISA反应板，37°C反应比。每孔加入200 洗涂液洗3次，每次Imin,洗完后用吸水纸拍干。
[0034] 做每孔加入100 的1:10000倍稀释（V/V)的HRP标记的兔抗猪IgG, 37 °C反 应40min，每孔加入200 U 1洗涂液洗5次，每次Imin,洗完后用吸水纸拍干。
[0035] (4)每孔加入显色液A液和B液各50 U 1，室温放置IOmin。
[0036] (5)加入50 U 1终止液终止反应