一种使用磁微粒化学发光定量检测抗M2-3E抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 M2-3E抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 抗M2-3E抗体IgG是一种用于诊断原发性胆汁性肝硬化(PBC)的血清学标志物，具 有较高敏感度、特异性，它对于出现临床体征的PBC患者，以及处于PBC发病早期而缺乏明显 肝功能异常或胆汁淤积症状者同样适用。目前临床上抗M2-3E抗体IgG的检测有的膜条免疫 法和酶联免疫吸附法。膜条免疫法应用的是膜条显色技术，其特点为固定几个项目在同一 膜条测定，一般通过手工或者半自动膜条仪进行实验操作，最终通过肉眼进行定性判定，该 技术灵敏度低，反应时间长，检测项目只能固定搭配组合，灵活性差。酶联免疫吸附法的灵 敏度在膜条免疫法基础上有所提升，但仍然较低，并且线性范围窄，重复性差，反应时间也 较长，仍然不能很好满足临床的应用。
[0003] 磁微粒化学发光免疫分析法，较以前的膜条免疫法和酶联免疫吸附法，在检测灵 敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，临床应用广。目前， 使用磁微粒化学发光分析法在抗M2-3E抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
[0004] 中国专利CN103105489A公开了检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其 制备方法，涉及一种检测多种自身免疫性疾病相关抗体的免疫印迹试剂盒，解决目前尚无 用于多种自身免疫性疾病体检筛查的免疫印迹产品技术上的不足:在所述的硝酸纤维素膜 或尼龙膜上含有：分别由(^0ΝΑ、5ι?/ΚΝΡ、(ΧΡ、55Α、55Β、6Α0、ΚΑ、ΙΑ-2Α、Τ6、ΑΜΑ-Μ2,1(^Φ* 的至少两种天然或重组抗原包被而成的两条以上平行的检测线，1条高浓度质控带，1条中 浓度质控带及1条低浓度质控带。该专利公开的是一种膜条免疫法，更能说明膜条免疫法存 在的灵敏度较低、线性范围窄、重复性差和反应时间长的问题。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Μ2-3Ε抗体IgG的试剂盒，能够低成本制备得到，且能够实现抗Μ2-3Ε抗体IgG准确和高精确 地定量测定。
[0006] 本发明是通过如下技术方案来实现的：一种使用磁微粒化学发光定量检测抗M2-3E抗体I gG的试剂盒，所述试剂盒包括:Ant i -M2-3E I gG校准品、Ant i -M2-3E I gG试剂1号、 Anti-M2-3E IgG试剂2号、Anti-M2-3E IgG磁分离试剂、Anti-M2-3E IgG质控品和清洗液。
[0007] 所述Anti-M2-3E IgG校准品包括6个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分 别为0、5、20、50、100、200RU/mL的Anti-M2-3E IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
[0008] 所述Anti-M2-3E IgG试剂1号为1个含有生物素标记的M2-3E抗原和牛血清白蛋白 的Tris缓冲液的瓶；
[0009]所述Anti-M2-3E IgG试剂2号为1个含有碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和 牛血清白蛋白的Tr is缓冲液的瓶；
[0010]所述Anti-M2-3E IgG磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白 蛋白的Tris缓冲液瓶；
[0011]所述Anti-M2-3E IgG质控品包括2个质控瓶，所述质控瓶内的浓度的范围分别为： 16-24RU/mL和80-120RU/mL。
[0012] 所述试剂盒检测原理为将待测样品、所述Anti-M2-3E IgG试剂1号混合温育，样品 中的抗M2-3E抗体IgG与M2-3E抗原特异性结合，再加入所述Anti-M2-3E IgG磁分离试剂，抗 M2-3E抗体IgG与M2-3E抗原的免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未结合的抗体和 杂质，加入Anti-M2-3E IgG试剂2号并混合温育。碱性磷酸酶标记(ALP)的羊抗人IgG抗体与 已经结合在磁珠上的抗M2-3E抗体IgG特异性结合。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入化 学发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与样品中抗M2-3E抗体IgG浓度呈正比，通过RLU就可以从标准曲线上计算出待测样品的抗M2-3E抗体IgG含 量。
[0013] 本发明采取的又一技术方案是:一种抗M2-3E抗体IgG的磁微粒化学发光定量检测 试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[0014] 步骤1.制备所述Anti-M2-3E IgG校准品包括:Anti-M2-3E IgG校准品稀释液配制 步骤和Anti-M2-3E IgG校准品配制步骤：
[0015] 所述Anti-M2-3E IgG校准品稀释液的配制步骤包括：
[0016] 加800mL纯化水和11.2g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠和2mL 的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，搅 拌至完全溶解，再将pH值调为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的 所述校准品稀释液保存在2_8°C待用；
[0017] 所述Anti-M2-3E IgG校准品的配制步骤包括：
[0018] 用上述Anti-M2-3E IgG校准品稀释液将抗M2-3E抗体IgG分别配制为0、5、20、50、 100、200RU/mL共6个浓度点；
[0019] 步骤2.制备所述Anti-M2-3E IgG试剂1号包括:Anti-M2-3E IgG试剂1号稀释液配 制步骤和Anti-M2-3E IgG试剂1号配制步骤：
[0020] 所述Anti-M2-3E IgG试剂1号稀释液的配制步骤：
[0021] 加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入 2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调 为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述试剂1号稀释液保存在 2_8°C待用；
[0022] 所述Anti-M2-3E IgG试剂1号的配制步骤：
[0023]用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照M2-3E抗原与 生物素溶液质量比为10:1的比例在M2-3E抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液， 混合均匀，室温静置18h，反应生成M2-3E抗原-生物素连接物的反应液，将得到的M2-3E抗 原-生物素连接物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到M2-3E抗原-生物素连接物，再用所述试剂1号稀释液将M2-3E抗原-生物素连接物稀释到0.1-0.3yg/mL， 得到所述的试剂1号；
[0024] 步骤3.制备所述Anti-M2-3E IgG试剂2号包括:Anti-M2-3E IgG试剂2号稀释液配 制步骤和Ant i-M2-3E IgG试剂2号的配制步骤：
[0025] 所述Anti-M2-3E IgG试剂2号稀释液的配制步骤：
[0026] 加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全 溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0. lg的ZnCl2、0.2mL的Proclin 300和0. lg的MgCh，搅拌至 完全溶解，将pH值调为7.5-8.0，用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述试 剂2号稀释液保存在2-8°C待用；
[0027] 所述Anti-M2-3E IgG试剂2号的配制步骤：
[0028]将lmg的羊抗人抗体和2-4yL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静 置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10yL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后 抗体，将活化后的抗体保存在2_8°C备用，取1.5mg的碱性磷酸酶，加入5mg/mL的4-(N-马来 酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20yL，室温静置30min，用G-25凝胶柱 除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8°C备用，再将上述活化的 羊抗人抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2_8°C条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯 化柱纯化，获得羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8°C保存备用，将羊抗人抗 体-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到0.02-0. lyg/mL，得到所述的试 剂2号；
[0029] 步骤4.制备所述Anti-M2-3E IgG磁分离试剂包括:Anti-M2-3E IgG磁分离试剂稀 释液配制步骤和Anti-M2-3E IgG磁分离试剂配制步骤：
[0030] 所述Anti-M2-3E IgG磁分离试剂稀释液配制步骤：
[0031] 加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的 牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300,搅拌至完全溶解，将pH值调为 7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在 2_8°C待用；
[0032] 所述Anti-M2-3E IgG磁分离试剂配制步骤：
[0033] 取10011^磁微粒，磁分离去上清，取用0.025111〇1/1的？!1值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸 缓冲液1 OmL重悬，室温下混勾2~3h，加入0.5 -1. OmL新配制的浓度为1 Omg/mL的碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁 分离，去上清，用0. 〇25mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的 链霉亲和素，室温混悬16_20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5%的牛血清白蛋 白，百分比浓度0.