检测甲状腺过氧化物酶抗体的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断技术领域，特别是涉及一种基于纳米磁微粒化学发光及碱性 磷酸酶标记检测甲状腺过氧化物酶抗体的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 甲状腺过氧化酶(ΤΡ0)是一种结合糖基化亚铁血红素的膜蛋白质，位于甲状腺卵 泡细胞的顶膜中。ΤΡ0是一种甲状腺微粒体抗原大蛋白质的主要成分，在甲状腺球蛋白中的 酪氨酰基团的碘化反应中起催化剂的作用，促进甲状腺激素、T3和T4的合成。甲状腺过氧化 酶自身抗体的检测是鉴定患者是否患有自身免疫性甲状腺疾病的一种有效手段。90%以上 患有自身免疫性甲状腺炎的病人，其体内的抗ΤΡ0抗体水平非常高。抗ΤΡ0抗体可以激活补 体，被认为是导致甲状腺机能失调和甲状腺机能减退的主要致病原因。在患有自身免疫性 甲状腺疾病的人群中，几乎每个淋巴瘤性甲状腺炎的患者和70%以上的甲状腺机能亢进患 者体内都存在抗ΤΡ0抗体。
[0003] 目前用于检测甲状腺过氧化物酶抗体(anti-TPO)的免疫分析方法主要有酶联免 疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现 全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的 一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前 化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。
[0004] 然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影 响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床 检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的 磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗 原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细 胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些 特殊成分得以分离、浓集或纯化。
[0005] 磁分离化学发光免疫分析法综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技 术一悬浮磁微粒载体技术、化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要 求。
[0006] 现有技术，如公开号为CN1595161A、公开日为2005-3-16的发明专利公开了 一种甲 状腺过氧化物酶抗体磁分离酶联免疫检测方法，但是该专利中的试剂盒的灵敏度仍然较低 (5IU/ml)，且试剂盒检测时间太长（>90min);再如公开号为CN103336115A、公开日为2013-10-02的发明专利公开了一种甲状腺过氧化物酶抗体磁分离酶联免疫检测方法，但是该专 利中的试剂盒的灵敏度仍然较低（lIU/ml)，试剂盒检测时间太长（>90min)，且检测范围较 窄（l-400IU/ml)。
【发明内容】
[0007] 本发明主要解决的技术问题是提供一种检测甲状腺过氧化物酶抗体的试剂盒及 方法，其极易实现全自动化，具有灵敏度高、精密度高、线性范围宽、检测时间短等优点。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种检测甲状腺过氧 化物酶抗体的试剂盒，包括第一试剂、第二试剂、质控品、标准品、磁分离试剂、样本稀释液， 所述第一试剂为含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的甲状腺过氧化物酶抗原溶液，所述第 二试剂为含碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液，所述磁分离试剂为偶联有链霉 亲和素的磁微粒悬浮液。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，所述第一试剂的浓度为5~1000ng/ml;所述第一试剂 中所述甲状腺过氧化物酶抗原与所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔比为1:15~50;所 述第一试剂中的所述甲状腺过氧化物酶抗原的纯度大于95%。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，所述第二试剂的浓度为10~1000ng/ml;所述第二试 剂中所述鼠抗人IgG单克隆抗体与所述碱性磷酸酶的摩尔比为1:1~2;所述第二试剂中的所 述碱性磷酸酶的纯度大于95%，比活性大于1000 U/mg，浓度大于5mg/ml;所述第二试剂中的 所述鼠抗人IgG单克隆抗体的纯度大于95%，浓度大于lmg/ml。
[0011 ] 在本发明一个较佳实施例中，所述磁分离试剂的浓度为0.05~1.0mg/ml;所述磁分 离试剂中的所述磁微粒具有超顺磁性，所述磁微粒的直径为〇. 5~2μπι，每克磁微粒表面的羧 基含量不低于0.4毫摩尔;所述质控品为甲状腺过氧化物酶抗体系列质控品;所述标准品为 甲状腺过氧化物酶抗体系列标准品。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，所述样本稀释液为含质量百分比为0.1%~5%的牛血 清白蛋白、pH值为7~8、0.005~0.06mol/L的磷酸盐缓冲液。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，所述第一试剂的制备方法为:将所述甲状腺过氧化 物酶抗原用〇. 01~〇. 〇3mol/L、pH为7~7.5的磷酸盐缓冲液，在2~8°C下透析过夜，配置成甲状 腺过氧化物酶抗原溶液;将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配置成N-羟基琥 珀酰亚胺生物素酯溶液，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的物质的量浓度为8~12mM; 将所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液加入到所述甲状腺过氧化物酶抗原溶液中，混合均 匀，在15~40°C下放置20~40分钟；加入0.9~1. 1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在 15~40°C下放置8~12分钟，然后用含质量比为0.4~3.2%的牛血清白蛋白、pH为7~7.5、物质 的量浓度为〇. 005~0.06mol/L的磷酸盐缓冲液稀释到含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的 甲状腺过氧化物酶抗原的浓度为5~1000ng/ml，即得所述第一试剂； 所述第二试剂的制备方法为:将鼠抗人IgG单克隆抗体加入到浓度为8~12mg/ml的2-亚 胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15~40°C下静置18~25分钟，加入0.09~0.11m〇l/L的甘氨酸溶 液，在15~40°C下静置4~5分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后鼠抗人IgG单克隆抗体，2~8 °C保存备用;将碱性磷酸酶溶液加入到4~5mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧 酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15~40°C下静置25~35分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性 磷酸酶，2~8°C保存备用;将活化后的鼠抗人IgG单克隆抗体和活化后的碱性磷酸酶混合，在 2_8°C下静置12~24h，用Supperd ex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2~8°C保存备 用;将所述连接物浓溶液用含质量比为〇. 4~3.2%的牛血清白蛋白、pH为5.8~8.0、物质的量 浓度为〇. 04~0.1 lmol/L的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的鼠抗人 IgG单克隆抗体的浓度为10~1000ng/ml，即得所述第二试剂； 所述磁分离试剂的制备方法为:将所述磁微粒用0.04~0.06mol/L、pH4.5~5的2-吗啉 乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为8~12mg/ml;然后加入所述链霉亲和素，在15~40 °C下混悬30~60分钟，其中所述磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为25~50:1;然后再加入 新鲜配置的8~12mg/ml的碳二亚胺水溶液，在15~40°C下混悬2~12h，其中所述2-吗啉乙磺酸 缓冲液与所述碳二亚胺水溶液的体积比为10~20:1;磁分离，去上清，用含质量比为0.