一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物领域，一种检测小分子G蛋白Rapl活性的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]小分子G蛋白RapI属于Ras家族，其结构类似于Ras，当结合GTP后处于活性状态(Rap 1-GTP )，结合GDP后则处于非活性状态(Rap 1-⑶P)。在细胞内，Rap I通过Rap 1-GTP与Rapl-GDP之间的动态转换起分子开关的作用，胞外信号通过特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子调控Rap I与GTP结合，从而激活RapI ；胞内特异性GTP酶激活蛋白促进GTP水解，从而使Rap I失活。活化的Rapl信号通过其下游不同的信号分子调控不同的生物学功能。胞外刺激因子例如生长因子、细胞因子、趋化因子以及第二信使Ca2+、DAG、cAMP等，可通过鸟嘌呤核苷酸交换因子激活Rapl从而调控不同的信号通路;而活化的大麻素受体可以通过下调GTP酶激活蛋白使已被激活的Rapl信号始终处于激活状态。因此，Rapl信号介导的生理功能呈现出多样性，对细胞增殖、分化、粘附、迀移等起不同的调控作用。1^?1通过1^^/^孤1/2、？38/^^1(/CREB或PI3K调控肿瘤细胞的增殖，还能通过调节钙粘着蛋白介导的细胞粘附作用而影响肿瘤细胞的浸润和迀移；在淋巴系统中，Rapl的病理性持续激活导致骨髓白血病;在神经系统中Rapl信号能促进神经元极性建立和轴突生长，还能调节神经突生长。Rapl信号能够调控神经突触结构和功能的可塑性变化，与神经元的迀移也具有相关性。因此，检测Rapl蛋白的活性对于了解肿瘤的增殖和迀移，以及研究其在神经系统中的功能具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的发明目的之一在于是提供一种检测小分子G蛋白Rapl活性的方法，利用该方法可检测组织或体外培养的细胞系中Rapl的活性水平。
[0004]本发明的目的之二在于利用上述方法检测小分子G蛋白Rapl活性的的试剂盒。
[0005]为解决上述问题，本发明提供包含谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠、IPbuffer、SDS-PAGEloading buffer、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂及可特异性结合Rapl-GTP的GST-RalGDS-RBD融合蛋白与可特异性识别Rapl抗体的试剂盒及检测方法。
[0006]其技术解决方案如下:一种检测小分子G蛋白Rapl活性的方法，根据人RalGDS基因的Rapl结合结构域(RBD)能够特异结合Rapl-GTP的特性，构建GST-RalGDS-RBD原核表达质粒，经诱导纯化得到GST-Ral⑶S-RK)蛋白，并利用GST pull-down和Western-Blot方法检测小分子G蛋白Rapl活性的方法；
其具体步骤如下:
步骤I构建GST-Ral⑶S-RK)原核表达质粒
Ral⑶S是Rapl下游的效应因子，含有Rapl结合结构域(位于其798-885位氨基酸残基)，可以直接结合Rapl-GTP。查询NCBI数据库中人RalGDS基因对应798-885位氨基酸残基的编码序列，对照原核表达载体PGEX-6P-1的多克隆位点(图1所示)，选择其中的BamH I和EcoRI位点作为酶切位点设计上游引物(S^CGCGGATCCGCGctgccgctctacaacd')和下游引物(57 - CCGGAATTCCGGtcagaagatgcccttggcaa-37 )，以人肝文库为模版，PCR扩增得到目的片段。经过琼脂糖凝胶电泳分离后用凝胶回收试剂盒回收，回收的目的片段和PGEX-6P-1空载体分别经BamH I和EcoR I双酶切后，再次经过琼脂糖凝胶电泳分离回收，回收的目的片段和载体以5:1的比例混合。然后用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，随后用该体系转化DH5a大肠杆菌，涂平板并挑选其中的阳性克隆，所选的阳性克隆经过限制性内切酶切后得到大约418bp的目的片段(图2所示)XST-RalGDS-RBD原核表达质粒测序得到的目的片段和NCBI数据库上的编码序列完全一致(图3所示)。这表明GST-RalGDS-RBD原核表达质粒构建成功。
[0007]步骤2 GST-RalGDS-RBD融合蛋白的原核表达和纯化
用上述构建的GST-RalGDS-RBD质粒转化BL21大肠杆菌，按1%转接于100 mL LB培养基中，37°C 180 r/min振荡培养至对数生长期(D6Qonm=0.6);随后按100 μΜ/L终浓度加入IPTG，20°C 180 r/min振荡诱导过夜;次日4°C 4000 rpm 1min离心收集菌液，将得到的大肠杆菌用30 mL缓冲液PB[30 mL PBS中含0.5 mM/L DTT^2 yg /mL Aprotimin、2 yg /mLLeupeptinU mM/L PMSFa mM/L Na3V04、10 mM/L NaF]重悬，然后高压破碎，随后超声波进一步破碎。4°C 13000 rpm 1min离心裂解产物，取上清，将预先经过平衡的300 yL谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠与离心后得到的上清混合，4°C混旋转2h，然后预冷的PB缓冲液洗涤谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠，利用洗脱缓冲液[5ml配方:250 yL 1M/L Tris-Cl，ph7.6、4.75mL超纯水、0.0154g还原型谷胱甘肽]把GST-Ral⑶S-RBD从凝胶珠上洗涤下来。最后利用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色方法检测纯化的GST-RalGDS-RBD融合蛋白(图4所示，大小约40kDa)。
[0008]步骤3 使用GST pull-down和Western-Blot方法检测Rapl的活性水平
将HEK293细胞接种于100 cm2培养皿，待细胞长到80%密度时，利用脂质体转染质粒RaplV12 (rapl基因组成型活性形式，表达产物相当于Rapl-GTP)。2处后收集细胞，先用PBS洗一次，然后用IP buffer裂解液冰上裂解细胞，12000 rpm离心10 min，取上清，留取其中2 O %作为对照。转染R a PIV12的细胞上清均分为两份，分别与偶联了 G S T空载体和G S T -RalGDS-RBD的谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠混合，置摇床上4°C混旋转Ih，4°C 6000 rpm离心，用IP裂解液洗涤三次，最后用微量进样器吸干Ep管内所有剩余液体，加入30 μ? SDS-PAGEloading buffer，煮沸10 min，最后通过western-blot检测目标Rapl蛋白。结果如图5所示，其中以GST空载体作为阴性对照，GST-Ral⑶S-RBD能够与HEK293细胞中表达的Rapl-GTP发生相互作用，并且这种相互作用具有很强的特异性。
[OOO9 ]利用脂质体转染质粒Rap IV12 (rap I基因组成型活性形式，表达产物相当于Rap 1-GTP)或RaplN17(rapl基因组成型失活形式，表达产物相当于Rapl-GDP)到HEK293细胞中。24h后收集细胞，先用PBS洗一次，然后用IP裂解液冰上裂解细胞，12000 rpm离心10 min，取上清，留取其中20%作为对照。偶联了GST-RalGDS-RBD的谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠分别与转染RaplV12的细胞上清和转染RaplN17的细胞上清混合，置摇床上4°C混旋转lh，4°C 6000 rpm离心，用IP裂解液洗涤三次，最后用微量进样器吸干Ep管内所有剩余液体，加入30 μ? SDS-PAGE loading buffer，煮沸10 min，最后通过western-blot检测目标Rapl蛋白。结果如图6所示，GST-RalGDS-RBD能够与HEK293细胞中表达的Rapl-GTP发生相互作用，但不和HEK293细胞中表达的Rap 1-GDP结合。本发明的基本原理
小分子G蛋白R a P I活性检测试剂盒基于谷胱甘肽S转移酶(g I u t a t h i ο n e S-transferase，GST)亲和层析和GST pul Ι-down方法。首先利用重组技术将谷胱甘肽S转移酶与含有Rapl结合区域(Rapl binding domain, RBD)的RalGDS-RBD融合。GST-Ral⑶S-RBD融合蛋白能通过GST与固相化在载体上的谷胱甘肽(Glutath1ne, GTH)亲和结合，也可以通过Rapl结合区域结合Rapl-GTP。当GST-RalGDS-RBD融合蛋白亲和结合在谷胱甘肽固化琼脂糖凝胶珠时，该固相载体能把Rapl-GTP从细胞或组织裂解液中pul Ι-down下来。IP裂解液洗去未与固相载体结合的蛋白后，然后制成供SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白样品。利用Western Blot的检测方法，使用Rapl抗体，S卩可特异性检测病理组织或细胞中Rapl的活性水平。
[0010]本发明方法的优点:
1.本发明采用的检测方法操作简单，易于标准化。
[0011]2.本发明采用的GST-RalGDS-RBD融合蛋白纯度高，特异性好。
[0012]3.本发明采用的磷酸酶抑制剂混合物能很好地抑制Rapl-GTP降解，从而保证实验结果的真实性。
[0013]本发明试剂盒的组成:
I.GST-Ral⑶S-RK)融合蛋白
规格:600 yg，可供30次pulΙ-down实验，蛋白纯化浓度>75% (图4所示)。
[0014]保存条件:溶解于50 mM Tris-HCl，10%甘油，0.02% NaN3中，保存在_80°C。用途:GST-RalGDS-RBD融合蛋白能通过GST与固相化在载体上的谷胱甘肽亲和结合，也可以通过Rap I结合区域结合Rap 1-GTP。
[0015]1.1P buffer规格:200 ml
用途:1P buffer用于病理组织或细胞裂解，保存在4°C。
[0016]注:使用时加蛋白酶抑制剂cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制剂。
[0017]1.Washing buffer
washing buffer用于洗涤谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠，保存在4°C。
[0018]注:使用时加蛋白酶抑制剂cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制剂。
[0019]2.谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠规格:450 μ?,保存在4°C。
[0020]用途:作为固相载体，用于结合GST-RalGDS-RBD融合蛋白。
[0021]3.SDS-PAGE loading buffer规格:1 ml,室温保存。
[0022]用途:含有4% SDS (w/v),2% glycerol和0.05%溴酚蓝，用于蛋白制样，保存在4?C。
[0023]4.Rap I 抗体
规格:ant1-Rapl (50 μ?, Sc~65,Santa Cruz公司)
用途:用于Western blot检测。
[0024]5.蛋白酶抑制剂Cocktail (50 μ?)，保存在_20°C。
[0025]6.磷酸酶抑制齐IJ 500 mM NaF (100 μ1)、100 mM Na3V04 (100 μ?)，保存在