低浓度瑞他莫林的测定方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体设及一种低浓度瑞他莫林的测定方法及应用。
【背景技术】
[0002] 瑞他莫林是截短侧耳素类半合成素抗生素，可应用于治疗脈瘤疮和小面积撕裂 伤、擦伤或缝合伤口出现的感染。分子式为C30也7N04S，化学名为[[(3-外)-8-甲基-8-氮杂二 环[3.2.1]辛烧]-3-琉基]-，（3aS，4R，5S，6S，8R，9R，9aR，10R)-4,6,9，10-四甲基-5-?基-6-乙締基十氨化-l-氧代-3a，9-丙烷-3aH-环戊环辛烧-8-乙酸醋，其化学结构式如下：
[0003]
[0004] 从上述结构式可知，无共辆基团，紫外吸收弱，最大吸收波长为209nm，该波长下基 线噪音大，干扰多；瑞他莫林软膏中主药规格为1 %，透皮试验中软膏上药量为lOmg/皮片， 主药上药量为O.lmg，接收溶剂体积为17ml，按透过率为0.1 %计算，接收液浓度约为 5.88ng/ml，常规的高效液相色谱法无法满足需求。也就是说，现有技术缺少一种对低浓度 瑞他莫林进行定量测定的有效方法。
[0005] 到目前为止，还没有公开的方法报道可有效对低浓度瑞他莫林进行定量测定。因 此开发一种测定低浓度瑞他莫林的方法，对于实现对瑞他莫林的质量控制、安全性保证具 有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种低浓度瑞他莫林的测定方法，该方法适用 于低浓度瑞他莫林的检测和测定，该方法能准确的检测极低浓度的瑞他莫林。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[000引低浓度瑞他莫林的测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱-串联质谱法进行测 定。
[0009]高效液相色谱-串联质谱技术化C-MS/MS)W液相色谱作为分离系统，质谱为检测 系统。样品在色谱柱上通过流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子分离，击 碎，再将碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用技术将高效液相色谱和质谱的 优势进行互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提 供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，实现对复杂混合物更准确的定性和定量分 析，并简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便，因此广泛应用于药物分析、食品分析 和环境分析等许多领域。
[0010]进一步，所述质谱采用多重反应监测模式，所述测定方法采用内标法，用泰妙菌素 作为内标物。
[0011 ] 多重反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM)是针对祀标分子的一种质 谱分析技术，该技术采用Ξ重四级杆质谱仪，检测祀标分子的母离子和子离子的质谱响应 信号，从而获取较灵敏和高重现性的定性和定量信息，由于运种监测模式具有高通量和低 变异度等优点，MRM已成为药物代谢产物、激素和农药杀虫剂等有机小分子定量分析的主要 技术。
[0012] MRM能够在复杂样品中对特定的分子质量进行定量检测的质谱分析技术，其本质 是质谱仪上的一种扫描模式，即在一级扫描下选择特定的母离子，再将其碰撞碎裂后在二 级扫描中分析它特定的碎片离子(子离子），由于MRM的分析针对有机分子的结构特异性，加 之母离子和子离子的双重质量筛选，可显著降低质谱信号的噪音干扰，从而提高祀标分子 的检测灵敏性和重复性。
[0013] 内标法是将一定浓度的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然 后对含有内标物的样品进行分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高），按公式 和方法即可求出被测组分在样品中的浓度。因此，选择合适的内标物尤为重要。内标物一般 应满足如下要求:与待测物结构相近，具有相识的化学性质，出峰时间相近且分离度大于等 于1.5,不发生化学反应。
[0014] 本申请发明人经过反复研究和筛选，发现了一种特别适合LC-MS/MS法测定低浓度 瑞他莫林的内标物质:泰妙菌素，其结构式如下：
[0015]
[0016] 进一步，所述瑞他莫林和所述泰妙菌素分别采用至少一对母离子及子离子的组合 进行定量监测。
[0017] 进一步，所述瑞他莫林采用的母离子及子离子的组合为:母离子m/z为518.3 ± 1， 子离子m/z为216.1 + 1。
[001引图1为瑞他莫林Q1全扫描质谱图。图中有[Μ+Η] +的离子峰，其中m/z为518.3±1的 离子峰强度最大，灵敏度最高，优选m/z为518.3 ± 1的离子为母离子。图2为瑞他莫林离子峰 m/z518.3±l的子离子扫描质谱图。图中216.1±1的碎片离子峰强度最大且稳定，此处优选 m/z为216.1 ± 1的离子为子离子。
[0019] 进一步，所述瑞他莫林采用的母离子及子离子的组合为:母离子m/z为494.4±1， 子离子m/z为192.0 + 1。
[0020] 图3为泰妙菌素Q1全扫描质谱图。图中有[Μ+Η] +的离子峰，其中m/z为494.4 ± 1的 离子峰强度最大，灵敏度最高，优选m/z为494.4 ± 1的离子为母离子。图4为泰妙菌素离子峰 m/z494.4±l的子离子扫描质谱图。图中192.0±1的碎片离子峰强度最大且稳定，此处优选m/z为192.0±1的离子为子离子。
[0021] 进一步，所述液相色谱采用的条件包括：
[0022] 色谱柱:十八烷基键合硅胶柱，250X4.6mm，5μπι;
[0023] 流动相：甲醇-水，体积比为75:25;并添加有机酸或者挥发性有机酸盐;所述流动 相中加入有机酸或者挥发性有机酸盐，有助于母离子离子化增加灵敏度等。所述有机酸为 甲酸和/或乙酸，体积百分比为0.05%-0.15%，优选0.1%;所述挥发性有机酸盐为甲酸锭 和/或乙酸锭，浓度为5-20mm〇Vl，优选lOmmoVl。
[0024] 进样量:5-100μ1;优选 10μ1。
[0025] 进一步，所述质谱采用的条件包括：
[0026] 离子源:ΑΡΙ3000电喷雾离子源化SI)，采用正离子模式检测；干燥气:化;干燥气压 力（Gas2):70psi;离子化溫度(ΤΕΜ)为300°C;雾化气（Gasl)为9;气帘气（CurtainGas)为 12;喷雾电压（IonSprayVo1tage)为4700V;碰撞气(CAD)6;射入电压巧P) 10V;碰撞室射出 电压(CXP)20V;
[0027] 瑞他莫林化合物参数:母离子m/z为518.3,子离子m/z为216.1，去簇电压(DP)70V， 聚焦电压(FP)340V，碰撞能量(CE)35V;
[002引内标物化合物参数:母离子m/z为494.4，子离子m/z为192.0，去簇电压(DPM0V，聚 焦电压(FP)200V，碰撞能量(CE)29V。
[0029] 进一步，所述有机酸为甲酸和/或乙酸，体积百分比为0.05%-0.15%;所述挥发性 有机酸盐为甲酸锭和/或乙酸锭，浓度为5-20mm〇Vl。
[0030] 本发明的目的之二在于提供一种低浓度瑞他莫林的测定方法在瑞他莫林制剂的 透皮试验测试中的应用。本发明中的测定方法在瑞他莫林制剂的透皮试验测试中专属性 强、灵敏度和准确度高、重复性好。
[0031] 本发明的目的之Ξ在于提供一种测定瑞他莫林软膏透皮试验样品的方法。为实现 上述目的，采用的技术方案为：
[0032] 采用TP-5型智能透皮仪，WpH7.4憐酸盐缓冲液(PBS)作为接收溶剂，50%甲醇溶 液作为皮片和皮上残留物处理溶剂，采用内标法，W泰妙菌属为内标物，用高效液相色谱Ξ 重四极杆串联质谱联用仪进行测定；
[0033] 测试参数设置包括：
[0034] 液相色谱仪：
[00巧]色谱柱:十八烷基键合硅胶柱，250X4.6mm，5WI1;
[0036] 流动相：甲醇-水，体积比为75:25;并添加有机酸或者挥发性有机酸盐；
[0037] 进样量：5-10μ1;
[003引质谱仪：
[0039] 离子源:ΑΡΙ3000电喷雾离子源化SI)，采用正离子模式检测；干燥气:化;干燥气压 力（Gas2):70psi;离子化溫度(ΤΕΜ)为300°C;雾化气（Gasl)为9;气帘气（CurtainGas)为 12;喷雾电压（IonSprayVo1tage)为4700V;碰撞气(CAD)6;射入电压巧P) 10V;碰撞室射出 电压(CXP)20V;
[0040] 瑞他莫林化合物参数:母离子m/z为518.3,子离子m/z为216.1，去簇电压(DP)70V， 聚焦电压(FP) 340V，碰撞能量(CE) 35V;
[0041 ]内标物化合物参数:母离子m/z为494.4，子离子m/z为192.0，去簇电压(DP)40V，聚 焦电压(FP)200V，碰撞能量(CE)29V。
[0042] 本发明的目的还在于提供一种泰妙菌素作为内标物在高效液相色谱法或者高效 液相色谱-串联质谱法测定瑞他莫林浓度中的应用。本申请发明人经过反复研究和筛选，发 现泰妙菌素特别适合LC-MS/MS法测定低浓度瑞他莫林，测定结果专属性强、灵敏度和准确 度高、重复性好。
[0043] 本发明的有益效果在于：本发明的低浓度瑞他莫林的测定方法采用高效液相色 谱-串联质谱法进行测定，质谱采用多重反应监测模式，并采用内标法，用泰妙菌素作为内 标物。该方法专属性强、灵敏度和准确度高、重复性好，其检测限能达到200pg/ml，定量限能 达到50化g/ml。填补了现有技术缺少一种对低浓度瑞他莫林进行定量测定的有效方法的空 缺，可广泛应用于低浓度瑞他莫林生物样品中浓度的测试，特别是瑞他莫林软膏透皮试验 中样品浓度的测试，对于实现对瑞他莫林的质量控制具有重要的意义。
【附图说明】
[0044] 图1为瑞他莫林Q1全扫描质谱图。（纵座标是强度Intensity,单位:cps;横座标是 质荷比m/z)
[0045] 图2为瑞他莫林离子峰m/z518.3 ±1的子离子扫描质谱图。（纵座标是强度 Intensity，单位:cps;横座标是质荷比m/z)
[0046] 图3为泰妙菌素Q1全扫描质谱图。（纵座标是强度Intensity,单位:cps;横座标是 质荷比m/z)
[0047] 图4为泰妙菌素离子峰m/z494.4 ±1的子离子扫描质谱图。（纵座标是强度 Intensity，单位:cps;横座标是质荷比m/z)
[004引图5为瑞他莫林定量限的HPLC-MRM色谱图。（纵座标是强度Intensity，单位：cps; 横座标是时间，单位:min)。图6-图8坐标含义相同。
[0049] 图6为瑞他莫林检测限的HPLC-MRM色谱图。
[0050] 图7为瑞他莫林软膏透皮试验皮内样品测定的HPLC-MRM色谱图。
[0051] 图8为瑞他莫林软膏透皮试验皮上样品测定的HPLC-MRM色谱图。
[0052] 图9为瑞他莫林对照品溶液和泰妙菌素对照品溶液分别配制成0.504ng/ml、 1.Olng/ml、2.0化g/ml、5.04ng/ml、20.2ng/ml、40.3ng/nd和60.5ng/ml的一系列溶液的标 准曲线示意图。
[0053] 图10为瑞他莫林对照品溶液和泰妙菌素对照品溶液分别配制成101ng/ml、126ng/ ml、151ng/ml、176ng/ml和20化g/ml的一系列溶液的标准曲线示意图。
[0054] 图11为瑞他莫林对照品溶液和泰妙菌素对照品溶液分别配制成161ng/ml、181ng/ 1111、202]1