悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种对测试用样品着色的方法，具体涉及一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置。
【背景技术】
[0002]免疫荧光染色技术是常用细胞与分子生物学实验方法，它应用抗原-抗体反应原理，以荧光物质标记抗体而进行抗原定位，用于观察目的蛋白的表达以及蛋白间是否存在共定位或共表达关系。
[0003]对于多见的贴壁细胞免疫荧光染色，常用且普遍采用的是使细胞“爬片”于多聚赖氨酸包被的载体表面，然后进行经典的染色操作。然而对于在干细胞研究中常用的悬浮细胞球，因为它不贴壁，所以在经典的实验操作过程中极易造成细胞球的丢失。尽管现有文献报道使用多聚赖氨酸包被的盖玻片即可将悬浮细胞球粘附于盖玻片[卜3]，但实际操作结果并非如此，即使使用多聚赖氨酸包被的盖玻片，仍仅有10%~20%细胞球会粘附于盖玻片表面，且其中95%以上的细胞球会在经典操作过程中丢失，最终导致样本量过少而实验失败。
[0004]针对悬浮细胞的不贴壁性，现有文献报道了多种可用于悬浮细胞球的免疫荧光染色方法。
[0005]中国专利文献CN102288471B公开了一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，该方法适用于悬浮细胞，完成实验至少需要10次以上细胞离心，此种方法不仅耗费时间和人力，而且将此种方法应用于悬浮细胞球时，由于细胞球的内层细胞和外层细胞表型不同，多次离心可使外层细胞脱离，损坏细胞球的结构和细胞组成，致最终检测的细胞球构成与实验操作前不同，影响实验结果的准确性。
[0006]还有文献报道用含10%血清培养基培养2h~4h可有助于细胞球粘附于盖玻片[1'2^6]。此种方法虽然克服了细胞球的不贴壁性，但细胞球需要在无血清条件下培养才能维持其表型，有血清培养会促进细胞球细胞分化m，改变其表型，干扰最终实验结果。且根据实验观察，细胞球于10%血清培养基培养30分钟即出现明显形态变化，细胞球外层细胞脱离细胞球并贴壁，说明细胞球已经发生表型改变，细胞组成由于有血清培养而被破坏。
[0007]Geraldo, S.等人研究发现将细胞球固定于胶原蛋白凝胶中确实可以保证细胞球不丢失M，但此种方法仍然存在缺陷:首先，凝胶中的胶原蛋白纤维会起到遮挡作用，影响共聚焦显微镜的激发光强度和穿透距离；其次，为了达到同样的染色效果，染色过程中需要抗体工作液浓度加倍甚至三倍，并延长抗体孵育时间，增加了消耗的时间和实验经费M。
[0008]Guerrero-Cazares, Η.等人研究将细胞球应用OCT包埋剂包埋制成冰冻组织切片再行免疫荧光染色[1°]，此种方法的缺点在于需要冰冻切片机，冰冻组织的切片需要具备专业技术的人员制备，且切片的过程中难以找到有细胞球的层面针对性取材，实验步骤繁琐，耗费时间很长。
[0009]参考文献
1.ffu, L.， et al.， Jiaweisinisan facili ta tes neurogenesis in thehippocampus after stress damage.Neural Regen Res, 2013.8(12): p.1091-102.2.Zhou, X.， et al.， Isolat1n，cultivat1n and identificat1n of braingl1ma stem cells by magnetic bead sorting.Neural Regen Res, 2012.7 (13): p.985-92.3.Velpula, Κ.K.， et al.， Cord blood stem cells revert gl1ma stem cell EMTby down regulating transcript1nal activat1n of Sox2 and Twistl.0ncotarget，2011.2(12): p.1028-42.4.Malla， R.R.， et al.， uPAR and ca thepsin B inhibit1n enhancedradi at 1n-1nduced apoptosis in gl1maini tia ting cells.Neuro Oncol, 2012.14(6): p.745-60.5.Sherman, J.H., et al., A novel fixative for immunofluorescence stainingof CD133~positive gl1blastoma stem cells.J Neurosci Methods, 2011.198(1): p.99-102.6.Yu, S.C.， et al.， Isolat1n and characterizat1n of cancer stem cellsfrom a human gl1blastoma cell line U87.Cancer Lett, 2008.265(1): p.124-34.7.Hong, X., K.Chedid，and S.N.Kalkanis，Gl1blastoma cell line-derivedspheres in serumcon taining medium versus serum-free medium: a comparison ofcancer stem cell properties.1nt J Oncol, 2012.41(5): p.1693-700.8.Geraldo, S., A.Simon, and D.M.Vignjevic, Revealing the cytoskeletalorganizat1n of invasive cancer cells in 3D.J Vis Exp, 2013(80): p.e50763.9.Artym, V.V.and K.Matsumoto, Imaging cells in three-dimens1nalcollagen matrix.Curr Protoc Cell B1l, 2010.Chapter 10: p.Unit 10 18 1-20.10.Guerrero-Cazares, Η.， K.L.Chaichana， and A.Quinones—Hinojosa，Neurosphere culture and human organotypic model to evaluate brain tumor stemcells.Methods Mol B1l, 2009.568: p.73-83。
【发明内容】
[0010]本发明是为了克服现有技术中存在的悬浮细胞球不贴壁生长难以制样以及现有悬浮细胞球免疫荧光染色方法存在的各种缺点而提出的，其目的是提供一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置。
[0011]本发明的技术方案是:
一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，所述染色方法包括以下步骤:
(i)组合细胞小室和染色套件，取细胞球悬液加入细胞小室，弃染色套件内培养基，清洗细胞球；
(ii)向细胞小室中加入组织细胞固定液固定，弃染色套件内液体，清洗细胞球；
(iii)向细胞小室中加入TritonX-100通透细胞，弃染色套件内液体，清洗细胞球；
(iv)向细胞小室中加入封闭液封闭，孵育，弃染色套件内液体；
(v)向细胞小室中加入抗目的蛋白的一抗工作液，孵育，恢复至室温，回收染色套件内一抗工作液，清洗细胞球； (vi)向细胞小室中加入抗一抗的荧光二抗工作液，孵育，弃染色套件(2)内液体，清洗细胞球；
(vii)向细胞小室中加入DAPI染液染色细胞核，弃染色套件内液体，清洗细胞球。
[0012]所述清洗细胞球的方法为重组细胞小室和染色套件，向细胞小室中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件，弃染色套件内PBS，重复操作三次。
[0013]所述步骤(vii)完成染色后，重组细胞小室和染色套件，向细胞小室中加入150ulPBS，置于湿盒中4 °C避光保存。
[0014]所述步骤(ii)中组织细胞固定液为多聚甲醛，多聚甲醛的加入量为lOOul，其质量浓度为4%，多聚甲醛固定时间为lOmin。
[0015]所述步骤(iii)中Triton X-100的加入量为lOOul，其质量浓度为0.2%,TritonX-100通透细胞的时间为lOmin。
[0016]所述步骤(iv)中封闭液为山羊血清，山羊血清的加入量为lOOul，其质量浓度为
2% ο
[0017]所述步骤(vi)中抗一抗的荧光二抗工作液的加入量为lOOul。
[0018]所述步骤(vii)DAPI染液的加入量为100ul，DAPI染液染色细胞核的时间为5min。
[0019]所述步骤(iv)中孵育的方法为置于湿盒中于37°C下孵育lh ;所述步骤(V)中孵育的方法为置于湿盒中4°C孵育过夜；所述步骤(vi)中孵育的方法为于湿盒中37°C避光孵育2ho
[0020]一种悬浮细胞球免疫荧光染色装置，包括细胞小室，所述细胞小室为上端敞口的圆台型结构，细胞小室的底面为有机材料膜，还包括套装于细胞小室下端外部的染色套件，染色套件是中空且上端敞口的圆台型结构，中部形成内底，内底为下陷的圆锥面。
[0021]本发明的有益效果是: