检测异菌脲的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测异菌脲的酶联免疫试剂盒 及其应用，可定性、定量检测烟叶中异菌脲的残留量。
【背景技术】
[0002] 异菌脲，又名扑海因，分子式为C13H13C12N 303,属于二甲酰亚胺类，是一种广谱性触 杀型保护性杀菌剂，广泛应用于烟草、果树、蔬菜的病害防治和水果的贮藏保鲜。异菌脲可 以通过根部吸收起内吸作用，可有效防治对苯并咪唑类内吸杀菌剂有抗性的真菌。其主要 防治对象为由葡萄孢菌、交链孢菌、核盘菌等引起的病害，如灰霉病、早疫病、黑斑病、菌核 病等。异菌脲农药是日本、美国、韩国、澳大利亚、加拿大和食品法典委员会国有限量要求的 检测项目，其在各类食品中最高残留限量为〇.〇5~15 mg/kg。目前，异菌脲的检测方法大多 为液相色谱法和气相色谱法，所能检测的基质种类较少，对烟草中异菌脲的检测方法的相 关专利和文献报道也较少。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种能够检测烟草中异菌脲药 物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定 量检测方法，应用本发明的酶联免疫法测定烟草中异菌脲的残留量，具有特异性好、操作简 单、检测快速、检测成本低等优点。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明试剂盒包括：包被有包被原 的酶标板、异菌脲标准品溶液、酶标二抗、异菌脲特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、 复溶液，所述包被原为异菌脲偶联抗原，所述包被原由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联制备 得到，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述异菌脲半抗原是由2, 6-二氯-4-硝基 苯酚为起始原料，经过与4-溴丁酸叔丁酯的烃基化反应得到羟基2, 6-二氯-4-硝基苯，还 原硝基后，得到烃基2, 6-二氯苯胺，烃基2, 6-二氯苯胺在碳酰氯的作用下，与氨基乙酸缩 合，得到烃基2, 6-二氯苯甘氨酸酯，再经过成环反应，得到异菌脲主体结构化合物，该化合 物再经碳酰氯作用，与异丙胺缩合，得到异菌脲母核结构化合物，在酸性条件下水解反应得 到的。
[0005] 所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋 白、血蓝蛋白。
[0006] 所述异菌脲半抗原的分子结构如式I :
[0007] 所述异菌脲特异性抗体是以异菌脲偶联抗原作为免疫原制备获得，所述异菌脲特异性 抗体为异菌脲单克隆抗体。
[0008] 所述酶标记的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣 根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四 甲基联苯胺，终止液为2 mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶 时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为2 mol/L硫酸。
[0009] 所述洗涤液pH值为L 4,含有(λ 5%~L 0%吐温-20、(λ 01%。~0· 03%。叠氮化钠防腐 剂、0. 1~0. 3 mol/L的磷酸盐缓冲液；其中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。
[0010] 所述复溶液为pH值为7. 0、0· 02 mol/L的磷酸盐缓冲液。
[0011] 所述异菌脲标准品溶液的浓度分别为〇 Kg/L、0.5 Pg/L、l. 5 Pg/L、4. 5 Pg/L、13.5 Kg/L、40. 5 Kg/L。
[0012] 其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9. 6,0. 05 mol/L的碳酸 盐缓冲液，封闭液为pH值为7. 1~7. 5,含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0. 1~0. 3 mol/L的磷酸盐 缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0013] 本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20 μ g/mL，每孔加 入100 μ L，25°C避光孵育2 h或4°C过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍 干，然后在每孔中加入150~200 yL封闭液，25°C避光孵育1~2 h，倾去孔内液体拍干，干燥 后用铝膜真空密封保存。
[0014] 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测异菌脲的方法，它包括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用试剂盒进行检测； (3) 分析检测结果。
[0015] 本发明检测异菌脲的酶联免疫试剂盒检测原理为：采用间接竞争ELISA方法，在 酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的异菌脲与微孔条上预包被的偶联抗原竞争 抗异菌脲的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含异菌脲的含量成 负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可定性或定量检测出样品中异菌脲 的残留量。本发明的试剂盒通过对2, 6-二氯-4-硝基苯酚进行结构改造，合成了带有四个 碳链长度的羧基半抗原，突出了异菌脲本身的分子结构，增强了免疫原性，使得制备得到的 异菌脲单克隆抗体灵敏度高，特异性强，试剂盒对样品的前处理方法简单，无需用到有机溶 剂，样品处理过程环保，能快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法 方便易行，便于携带，试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高、操作简单、检测 时间短、检测成本低等特点适于大批量烟草样品的定性、定量筛查。
【附图说明】
[0016] 图1为异菌脲半抗原合成路线图； 图2为试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0018] 实施例1试剂盒组分的制备 1、异菌脲半抗原的制备 化合物a的合成：取5.0 g 2, 6-二氯-4-硝基苯酚与3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中 搅拌，再向其中加入2.6 g无水碳酸钾作为催化剂在60°C反应8 h，反应停止后，蒸干溶剂， 再加水与乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，浓缩，过200-300目硅胶柱，层析分离纯化， 得到化合物 a 5.23 g，收率 87%。1HNMR(CDC13,300MHZ)S: 7.945 ( 1H, d, J=0.000), 4.144 ( 2H, t, J=7. 500), 7.945 ( 1H, d, J=0.000), 1.973 ( 2H, tt, J=7. 500, J=7. 367)，2.359 (2H, t, J=7. 367)，1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H，s)。
[0019] 化合物b的合成：向20 mL水中加入3. 1 g锌粉和1 mL冰乙酸，在90°C反应 30 min，再加入5. 2 g化合物a的乙醇溶液80 mL，在60°C反应4 h，待反应停止，抽滤，蒸 干，向其中加水与二氯甲烷萃取，静置，用无水硫酸钠干燥，用体积比为石油醚：乙酸乙酯 =20:1 重结晶，得到化合物 b 4.8 g，收率 91%。1H NMR (CDC13,300MHZ) δ:6·898 (1H, d, J=0.000), 4.039 (2H, t, J=7. 500), 6.898 (1H, d, J=0.000), 1.965 ( 2H, tt, J=7. 500, J=7. 367), 2.361 ( 2H, t, J=7. 367), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H, s), 1.414 (3H, s)。
[0020] 化合物c的合成：取4. 7 g化合物b用100 mL乙腈溶解，搅拌，向其中加入2. 16 g氨基乙酸，在氮气保护下，通入碳酰氯，在50°C下反应7 h，停止反应后，再加入50 mL氢氧 化钠水溶液，震荡，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗涤，浓缩，蒸干，过200- 300目 硅胶柱，层析分离，得到化合物c 3.57 g，收率73%。1H NMR (CDC13，300MHZ) δ :7.536 ( 1H, d, J=0.000), 4.037 ( 2H, t, J=7. 500), 7.535 ( 1H, d, J=0.000), 1.968 ( 2H, tt, J=7. 500, J=7. 367), 2.362 ( 2H, t, J=7. 367), 3.751 ( 2H, s), 1.414 (3H, s), 1. 414 ( 3H, s), 1. 414 ( 3H, s)。
[0021] 化合物D的合成：取3. 4 g化合物c，用1,2-二