一种从土壤中提取分离紫云英苷的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种从土壤中提取分离紫云英苷的方法。
【背景技术】
[0002] 随着全球经济一体化，国际、国内贸易往来越来越频繁，生物成功入侵的机率也大 大增加，外来物种的入侵对生态环境的破坏已经十分明显，所引起的生态问题也非常严重。
[0003] 2001年在天津南开及河北衡水首次发现的黄顶菊成为了新入侵并对农业危害较 大的外来入侵植物。黄顶菊（Flaveriabidentis(L. )Kuntze)，起源于南美洲，自黄顶菊被 发现以来，其发生面积越来越大，2008年-2010年有关省市植保环保部门在北京、天津、河 北、山东开展了黄顶菊的普查工作，调查结果显示，目前北京市自然环境内未发现黄顶菊； 天津市黄顶菊发生面积约10826亩，涉及到汉沽、静海、西青、蓟县等；河北省邯郸、邢台、衡 水、沧州、廊坊的16个县（市、区）已经不同程序发生了黄顶菊危害，发生面积约34. 5万 亩。另外，在山东省聊城市东昌府区和临清市以及德州市夏津县的乡村路边、空地均发现有 黄顶菊发生，河南省安阳县有零星发生，局部已经形成了黄顶菊种群。黄顶菊一旦侵入农 田，由于其中后期生长速度快，植株高大，与农作物争肥、争水、争光，严重抑制农作物生长， 导致作物减产。紫云英苷又名黄芪苷，结构如式（I)所示，是存在于多种植物中的一种黄 酮苷。1955 年，日本学者ToshioNakabayashi从一种蕨类植物（Pteridiumaquilinum) 中分离出紫云英苷（NakabayashiT.Isolationofastragalinandisoquercitrinfrom bracken,Pteridiumaquilinum.BulletinoftheAgriculturalChemicalSocietyof Japan，1955, 19(2) :104-109)。国内研究中，谢倩倩分离纯化了黄顶菊中的紫云英苷，并获 取了 4. 4mg纯度98 %以上的紫云英苷，并明确了紫云英苷的动态变化规律，得出紫云英苷 是黄顶菊中含量最高的黄酮苷，不同样品中紫云英苷含量为〇. 79-16. 36mg/g，这表明紫云 英苷对黄顶菊的生长发育起着非常重要的作用（谢倩倩.外来入侵植物黄顶菊中活性成分 的分离分析、结构鉴定及活性研究.北京：北京化工大学.2012)。
[0004]
[0005] 土壤是黄顶菊与伴生植物进行互作、共生的基本环境，紫云英苷是黄顶菊植株体 内含量最高的黄酮类物质，紫云英苷经黄顶菊根部分泌、植株淋溶等方式进入土壤后，与土 壤生物因子与非生物因子发生作用，有利于黄顶菊的成功入侵，因此，阐明紫云英苷在土壤 中的环境行为，是解析黄顶菊入侵机制的关键环节，研究紫云英苷在黄顶菊根际土壤中的 环境行为的前提条件是如何快速有效的从土壤中提取分离紫云英苷，从而能够更好地从次 生代谢角度解释黄顶菊入侵机制，为防控黄顶菊提供机理性技术支持。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了从土壤中提取分离紫云英苷，以研究紫云英苷在黄顶菊根际 土壤中的环境行为，从而更好地从次生代谢角度解释黄顶菊入侵机制，为防控黄顶菊提供 机理性技术支持。
[0007] 本发明提供了一种从土壤中提取分离紫云英苷的方法，所述方法包括：
[0008] (1)将土壤样品过10-40目筛，然后在60-80°C烘干至恒重；
[0009] (2)加入提取液，混匀后超声提取25-35min，然后离心收集上清液；
[0010] (3)离心后的沉淀重复进行步骤（2) 1-2次；
[0011] (4)合并步骤（2)和步骤（3)的上清液，蒸发浓缩除去甲醇；
[0012] (5)进行固相萃取；
[0013]其中，所述提取液为 0· 01-0. 02g/mL的EDTA水溶液、(λ06-0. 08g/mL的NaHC03水 溶液、甲醇的混合液，EDTA水溶液和NaHC03水溶液的总体积与甲醇的体积比为1 :0. 25-4。
[0014] 优选地，EDTA水溶液和NaHC03水溶液的总体积与甲醇的体积比为1:1-4。
[0015] 优选地，EDTA水溶液和NaHC03水溶液的体积比为1 :0. 5-1. 5,更优选为1: 0. 9~1, 2〇
[0016] 优选地，步骤（2)中，相对于lg经步骤（1)处理后的土壤，提取液的加入量为 2-4mL〇
[0017] 优选地，步骤（2)中，离心的条件包括：转速为4000-6000rpm，时间为4-6min。
[0018] 优选地，步骤（5)中，固相萃取的条件包括：固相萃取柱为Poly-SeryHLBSPE小 柱，依次用甲醇、超纯水淋洗柱子进行活化，用甲醇进行洗脱。
[0019] 本发明的从土壤中提取分离紫云英苷的方法，简单、提取较彻底，本发明方法为研 究紫云英苷在黄顶菊根际土壤中的环境行为提供了基础，从而能够更好地从次生代谢角度 解释黄顶菊入侵机制，为防控黄顶菊提供机理性技术支持。
[0020] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0021] 图1为紫云英苷标准液的高效液相色谱图。
[0022] 图2为实施例1中从土壤中提取分离的物质的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0023] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024] 本发明提供了一种从土壤中提取分离紫云英苷的方法，该方法包括：
[0025] (1)将土壤样品过10-40目筛，然后在60_80°C烘干至恒重；
[0026] (2)加入提取液，混匀后超声提取25_35min，然后离心收集上清液；
[0027] (3)离心后的沉淀重复进行步骤（2) 1-2次；
[0028] (4)合并步骤⑵和步骤（3)的上清液，蒸发浓缩除去甲醇；
[0029] (5)进行固相萃取；
[0030]其中，所述提取液为 0· 01-0. 02g/mL的EDTA水溶液、0· 06-0. 08g/mL的NaHC03水 溶液、甲醇的混合液，EDTA水溶液和NaHC03水溶液的总体积与甲醇的体积比为1 :0. 25-4。
[0031] 本发明中，尽管按照上述方法，即可实现本发明的目的，即能够简单且较彻底地从 土壤中提取分离紫云英苷，但当Η)ΤΑ水溶液和NaHC03水溶液的总体积与甲醇的体积比为 1:1-4时，能够更好地提取分离紫云英苷，使紫云英苷提取的更加彻底。因此，优选地，EDTA 水溶液和NaHC03水溶液的总体积与甲醇的体积比为1 :1-4。
[0032] 本发明中，EDTA水溶液和NaHOVK溶液的体积比优选为1:0.5-1. 5,更优选为1: 0. 9-1. 2。在该优选情况下，可使紫云英苷提取的更加彻底。
[0033] 本发明步骤（1)中，将土壤样品过10-40目筛，然后在60_80°C烘干至恒重，本发明 中，将土壤过筛是为了去除小石子等杂物，因此，本领域技术人员应该理解的是，过筛后是 将通过筛子的筛下物在60-80°C烘干至恒重。
[0034] 本发明步骤（2)中，对于提取液的加入量无特殊要求，可以为本领域常规的用量， 例如，相对于lg经步骤（1)处理后的土壤，提取液的加入量可以为2-4mL。
[0035] 本发明步骤（2)中，对于混匀的方式无特殊要求，可以采用本领域常规的方式混 匀。
[0036] 本发明步骤（2)中，对于超声提取无特殊要求，可以采用本领域常规的方式，例 如，可以在超声波提取仪中进行，对于超声提取的温度无特殊要求，例如可以为25_30°C。
[0037] 本发明步骤（2)中，离心的条件优选包括：转速为4000-6000rpm，时间为4-6min。
[0038] 本领域技术人员应该理解的是，本发明步骤（3)中，离心后的沉淀重复进行步骤 (2) 1-2次，即是指将离心后的沉淀加入提取液，混匀后超声提取25-35mi