pMalc2中，并且可使用大肠杆菌表达系统高产 率表达来自pMalc2的MBP基因（MalE产物）。从两个单独的细胞裂解物的SDSPAGE和 Western印迹分析中来获得结果。对应于66KDa的表观分子量的条带与在文献中报道的 MBP-hERa LBD的分子量具有良好一致性。
[0124] 夸体纯化和针对融合夸体的抗体牛产
[0125] 在八民14_蛋白质纯化系统上纯化hER a LBD和ARLBD。将直链淀粉作为固相的一 步亲和纯化系统用于MBP-hERa LBD蛋白质的高效纯化。针对hERa LBD的雌激素结合形式 和未结合形式产生了抗体。在较高的血清稀释度下（>1〇2)存在hERa LBD的E2结合形式 与未结合形式之间的一定程度上的区别。在较低的血清稀释度下灵敏度降低（10 1至10 2) 并且第一抗体不能区分hERa LBD的两种形式。
[0126] 结合研究
[0127] 在聚苯乙烯微量滴定板中进行初始测试。将载有hER a LBD的Pluronic-DMDDO包 被在聚苯乙烯微量滴定板的表面上。在实验中所使用的两种对照包括用Pluronic F108的 孔和未包被的孔。当与对照的（仅用Pluronic F108包被的孔和未经包被的孔）相比时，在 用载有hERa LBD的Pluronic-DMDDO包被的孔中可示出显著较高结合的放射性雌激素，表 明hERa LBD的固定化。载有his6-ARLBD的第二个Pluronic-DMDDO实验产生了类似结果， 其中与对照相比，载有蛋白质的孔能够结合显著较高量的放射性配体。这些实验清楚地表 明概念的证明，因为很显然，通过分别与水溶液中的雄激素化合物和雌激素化合物相结合， 不仅是雄激素和雌激素受体的LBD被固定，而且受体也保持生物活性。
[0128] 在CA/直链淀粉平片膜结合试验之前，使用3HE2测试了在树脂上的重组蛋白 质MBP-hERa LBD的活性和结合。对于E2结合的确定，将直链淀粉树脂的浆料用含有 MBP-hER a LBD的提取物孵育过夜。之后将洗涤过的浆料用300 μ L含有3HE2工作溶液的缓 冲液A在室温下孵育3小时。重复洗涤步骤并将4mL闪烁混合液添加到浆料中。将混合物 转移到闪烁瓶中，之后使用液体闪烁计数器计数。
[0129] 结论
[0130] 本发明人认为，本发明提供了用于检测内分泌干扰化合物的新检测装置，并且最 终证明了通过在惰性膜接触器上的人雌激素受体和雄激素受体的LBD的雌激素化合物和 雄激素化合物的亲和固定是可能且实际上可行的。
【主权项】
1. 用于检测内分泌干扰化合物的检测装置，其包括： 支撑结构；以及 固定在所述支撑结构上的至少一种性激素受体的配体结合结构域（LBD)。2. 根据权利要求1所述的检测装置，其中所述检测装置包括在所述支撑结构与所述配 体结合结构域之间的连接分子，其用于将所述LBD固定在所述支撑结构上。3. 根据权利要求1所述的检测装置，其中所述内分泌干扰化合物是雄激素化合物和雌 激素化合物的任意一种或两种的形式。4. 根据权利要求3所述的检测装置，其中所述性激素受体是雌激素受体和雄激素受体 的任意一种或两种的形式。5. 根据权利要求4所述的检测装置，其中所述性激素受体是分别具有配体结合结构域 hERaLBD和hARLBD的人雌激素受体和人雄激素受体的任意一种或两种的形式。6. 根据权利要求5所述的检测装置，其中所述配体结合结构域包含肽标记物并且是 his6-hERaLBD和his6-hARLBD的任意一种的形式。7. 根据权利要求5所述的检测装置，其中所述配体结合结构域hERaLBD表达为融合蛋 白并且是麦芽糖结合蛋白-hERaLBD(MBP-hERaLBD)的形式。8. 根据权利要求1所述的检测装置，其中所述至少一种性激素受体的配体结合结构域 是通过克隆编码所述配体结合结构域的基因并在宿主中表达所述基因来制备的。9. 根据权利要求8所述的检测装置，其中所述宿主是大肠杆菌。10. 根据权利要求2所述的检测装置，其中所述支撑结构是膜的形式。11. 根据权利要求2所述的检测装置，其中所述支撑结构是膜接触器（条带基质）的形 式。12. 根据权利要求11所述的检测装置，其中所述膜接触器是醋酸纤维素杂化膜的形 式。13. 根据权利要求12所述的检测装置，其中所述醋酸纤维素杂化膜是亲和性醋酸纤维 素-直链淀粉杂化膜的形式。14. 根据权利要求13所述的检测装置，其中所述连接分子是麦芽糖结合蛋白的形式。15. 根据权利要求10所述的检测装置，其中所述支撑结构是惰性膜的形式。16. 根据权利要求15所述的检测装置，其中所述惰性膜是合成聚合物膜的形式。17. 根据权利要求16所述的检测装置，其中所述合成聚合物膜是使用浸没沉淀技术制 造的。18. 根据权利要求16所述的检测装置，其中所述合成聚合物膜是平面且无孔的。19. 根据权利要求16所述的检测装置，其中所述合成聚合物膜是由聚砜（PSU)、聚醚酰 亚胺（PEI)和聚偏二氟乙烯（PVDF)溶液的任意一种或更多种铸造而成的。20. 根据权利要求19所述的检测装置，其中所述连接分子是经改性的泊洛沙姆的形 式。21. 根据权利要求20所述的检测装置，其中所述泊洛沙姆是以伯羟基为末端的双功能 嵌段共聚物表面活性剂的形式。22. 根据权利要求21所述的检测装置，其中所述泊洛沙姆是聚（乙二醇）-嵌段-聚 (丙二醇）-嵌段-聚（乙二醇）（称为PluronicF108)的形式。23. 根据权利要求22所述的检测装置，其中所述经改性的PluronicF108是其中所述 羟基终端基团被改性为金属螯合部分的PluronicF108的形式，所述金属螯合部分可特异 性结合Ni离子并用作固定化金属亲和色谱基质以及提供金属亲和性固定化受体配体结合 结构域。24. 根据权利要求23所述的检测装置，其中乙二胺四乙酸二酐通过两步反应与 PluronicF108的末端羟基终端基团偶联以产生新的金属亲和性配体，Pluronic-N,N二 羧甲基-3, 6-二氮杂辛烷二酸盐（Pluronic-DMDDO)。25. 检测内分泌干扰化合物的方法，其包括： 使根据权利要求1至24所述的检测装置与待测试样品接触，以使得如果所述样品包含 内分泌干扰化合物，则所述化合物将与所述配体结合结构域结合；以及 进行比色试验以指示所结合的内分泌干扰化合物。26. 根据权利要求25所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中所述待测试样品是水 样的形式。27. 根据权利要求26所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中使所述检测装置与所 述样品接触是通过以下的任意一种进行：将所述检测装置浸没在所述样品中、将所述样品 滴在所述检测装置上以及将所述检测装置蘸在样品中。28. 根据权利要求26所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中进行所述比色试验包 括以下步骤： 用EDC来使所述配体结合结构域饱和，在其上所述配体结合结构域构象改变并被活化 形成经活化的EDC-配体结合结构域复合物； 针对所述经活化的EDC-配体结合结构域复合物添加单克隆抗体，并使所述单克隆抗 体与所述经活化的EDC-配体结合结构域复合物结合， 在酶联免疫试验中使用所述单克隆抗体；以及 观察所结合的酶，其指示在所述样品中EDC的存在。29. 根据权利要求28所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中所述酶是产生经活化 的结合受体的有色、荧光以及发光衍生物的任意一种的酶的形式。30. 根据权利要求29所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中所述酶是辣根过氧化 物的形式。31. 根据权利要求26所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中进行所述比色试验包 括以下步骤： 添加特异性受体的酶标记的类固醇配体；以及 确定受体饱和的程度。32. 根据权利要求26所述的检测内分泌干扰化合物的方法，其中进行所述比色试验包 括以下步骤： 添加热休克蛋白，其结合并活化所结合的受体；以及 添加针对所述热休克蛋白的抗体以指示所结合的受体，从而指示内分泌干扰化合物结 合。33. 根据权利要求1所述的用于检测内分泌干扰化合物的检测装置，基本上如本文所 描述和说明的。34. 根据权利要求25所述的检测内分泌干扰化合物的方法，基本上如本文所描述和说 明的。35. 用于检测内分泌干扰化合物的新检测装置，以及检测内分泌干扰化合物的新方法， 基本上如本文所描述的。
【专利摘要】本发明涉及检测内分泌干扰化合物。特别地，本发明提供了用于检测内分泌干扰化合物的检测装置，所述检测装置包括支撑结构和固定在支撑结构上的至少一种性激素受体的配体结合结构域(LBD)。所述检测装置还包括在支撑结构与配体结合结构域之间的连接分子，其用于将LBD固定在支撑结构上。
【IPC分类】C07K17/00, C07K14/72, G01N33/74
【公开号】CN105378485
【申请号】CN201480034407
【发明人】P·斯瓦特, B·E·特鲁博迪
【申请人】斯泰伦博斯大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年5月6日
【公告号】EP2994760A2, US20160069910, WO2014181254A2, WO2014181254A3