微流体协同酶增强反应性ceer免疫测定法

微流体协同酶增强反应性ceer免疫测定法
【专利说明】微流体协同酶増强反应性CEER免疫测定法
【背景技术】
[0001] 传统上对大量患者的流行病学研究没有考虑到给定的人群中每个个体的遗传变 异性。这导致特定的药物或治疗剂对一些个体十分有效，但对其他个体不十分有效。个性 化医疗的目标是确保给定的药物以正确的剂量给予正确的个体。
[0002] 可使用各种生物标志物如基因、SNP、酶活性、蛋白质表达和活化以及它们对代谢 途径的影响，来开发治疗剂的优化策略。相关生物标志物的鉴别可被用来开发可用于了解 药物功效和副作用风险的诊断测定法。选择适当的剂量或给药方案，对于优化患者的响应 和使患者的风险最小化可能是十分重要的。
[0003] 适当生物标志物的鉴别，是用于个性化医疗的诊断测定法和试剂盒的开发中的重 要的第一步。一旦鉴别了生物标志物，可验证其存在或不存在，然后使用诊断测试进行定量 或测量。在某些情况中，使用护理点（point-of-care)方法，其中在可进行医疗测试和/或 治疗的患者护理场所之处或附近的位置进行该测定法。例如，护理点的位置可包括但不限 于医院、患者家庭、医师办公室或急诊场所。
[0004] 在护理点快速诊断医学病症、选择适当的疗法或优化剂量的好处具有许多优点。 使药物、剂量和治疗方案个性化，意味着患者具有得益于现代医学的最佳机会。本领域需要 新的方法来使用护理点装置鉴别和测量对患者具有临床好处的生物标志物。本发明满足这 个需求及其他需求。

【发明内容】

[0005] 在一个实施例中，本发明提供一种用于对样品进行多重免疫测定法如微流体协同 酶增强反应性（CEER)免疫测定法的方法，如体外方法。该方法包括：
[0006] (a)使细胞裂解物与附着于编码的微载体的、对至少一种被分析物具有特异性的 多个捕获抗体接触，以形成多个捕获的被分析物。
[0007] (b)使该多个捕获的被分析物与至少两种类型的对相应的被分析物具有特异性的 检测抗体接触，其中，至少一种类型的检测抗体具有信号放大对的第一成员，以形成多个可 检测的捕获的被分析物；
[0008] (c)使该多个可检测的捕获的被分析物与该信号放大对的第二成员接触，以产生 放大的信号；并且
[0009] (d)检测从该信号放大对的第一和第二成员产生的放大的信号。
[0010] 在一些实施例中，编码的微载体由选自以下的材料制成：乳胶、聚苯乙烯、交联葡 聚糖、聚甲基苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、氟化乙 烯-丙烯、玻璃、Si02、硅、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯）、金、银、铝、钢和SU-8。在一个实施例 中，编码的微载体由硅制成。
[0011] 在一些实施例中，编码的微载体被成形为选自以下的成员：球体、薄片体、正方体、 圆盘体、长方体、圆环体、三角体和六角体。在一个实施例中，编码的微载体被成形为薄片 体。
[0012] 在一些实施例中，编码的微载体包括多个微载体。
[0013] 在一些实施例中，该多个微载体具有至少两个群体。在一些情况中，该至少两个群 体的编码的微载体中的每一个群体具有不同的功能。在一个情况中，具体的功能可通过该 编码鉴别。
[0014] 在一些实施例中，编码的微载体具有功能，该功能通过读取该编码进行确定。在一 些情况中，该编码呈该微载体中的穿越孔的构型的形式。在另一个情况中，具体的功能是该 多个捕获抗体的种类（identity)。
[0015] 在一些实施例中，样品选自全血、血清、血浆、尿液、痰液、支气管灌洗液、泪液、乳 头抽吸物、淋巴液、唾液、脑脊髓液（CSF)、细针抽吸物（FNA)及它们的组合。
[0016] 在另一个实施例中，检测抗体包括：
[0017] (i)多个用促进部分（facilitatingmoiety)标记的活化状态非依赖性抗体，和
[0018] (ii)多个用信号放大对的第一成员标记的活化状态依赖性抗体。
[0019] 在一些方面，促进部分产生氧化剂，该氧化剂传送到（channelto)信号放大对的 第一成员并与该第一成员反应。在某些情况中，促进部分是葡萄糖氧化酶。在某些方面，氧 化剂是过氧化氢（H202)。在某些方面，信号放大对的第一成员是过氧化物酶。在某些情况 中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶（HRP)。
[0020] 在某些方面，信号放大对的第二成员是酪胺（tyramide)试剂。在某些情况中，酪 胺试剂是生物素-酪胺。
[0021] 在一些实施例中，放大的信号是通过过氧化物酶将生物素-酪胺氧化生成活化的 酪胺而产生的。在一些方面，直接检测活化的酪胺。在其他方面，在添加信号检测试剂时检 测活化的酪胺。在一些情况中，信号检测试剂是链霉亲和素标记的荧光团。在其他情况中， 信号检测试剂是链霉亲和素标记的过氧化物酶和显色试剂的组合。在一些实施例中，显色 试剂是3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)。
[0022] 在一些实施例中，本文提供的方法被用作人类疾病诊断测试。在一些方面，疾病是 代谢疾病、脑和认知障碍、脑障碍、认知障碍、胃肠疾病或癌症。
[0023] 在一些方面，代谢疾病是糖尿病，包括前驱糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、其他 形式的糖尿病和与糖尿病相关的障碍。
[0024] 在一些方面，脑和认知障碍是阿尔茨海默病。
[0025] 在一些情况中，癌症是选自以下的成员：乳腺癌、结肠直肠癌、胃肠道间质瘤、胃肠 道类癌肿瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌、前列腺癌和胃癌。
[0026] 在一些实施例中，该至少一种被分析物包括至少一种信号转导分子、病理蛋白或 自身抗体。
[0027]在一些情况中，该至少一种信号转导分子选自AMP活化的蛋白激酶（AMPK)、AMPK 激酶（AMPKK)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶（CAMKK)、LKB1、转化生长因子-β-活化的激 酶1 (ΤΑΚ1)、ΑΚΤ、脂连蛋白、瘦蛋白、葡萄糖、其他AMPK调节物及它们的组合。
[0028] 在其他情况中，该至少一种病理蛋白选自tau蛋白、活化的（磷酸化的）tau蛋白、 β淀粉样（Αβ)肽、可溶性淀粉样前体蛋白（ΑΡΡβ)、它们的片段、它们的复合物及它们的 寡聚物。
[0029] 在其他情况中，该至少一种自身抗体选自GAD65自身抗体、胰岛瘤-抗原2 (ΙΑ-2) 自身抗体、胰岛素自身抗体（IAA)、锌转运蛋白8(ZnT8)自身抗体及它们的组合。
[0030] 在另外其他情况中，该至少一种信号转导分子是受体酪氨酸激酶。在某些实施 例中，受体酪氨酸激酶是选自以下的成员：HER1、HER2、HER3、HER4、VEGFR-1、VEGFR-2、 VEGFR-3、FLT-3、FLK-2、PDGFR、c-KIT、INSR、IGF-IR、IGF-IIR、IRR、CSF-1R、cMET及它们的 组合。在其他实施例中，该至少一种受体酪氨酸激酶还包括非受体酪氨酸激酶。
[0031] 在一些实施例中，样品流过包含编码的微载体的微通道。在一些方面，微通道在至 少一个侧面上是透明的。
[0032] 在一些实施例中，放大的信号与编码的微载体的种类相关联。在一些情况中，放大 的信号与动力学结合参数相关联。这些参数包括例如详细的结合动力学参数，如缔合速率 k。。、解离速率kd或亲和常数Ka。
[0033] 本文的方法优选是体外方法。在一个实施例中，本发明提供一种用于对样品进行 多重免疫测定法如微流体协同酶增强反应性（CEER)免疫测定法的体外方法，该方法包括：
[0034] (a)使细胞裂解物与附着于编码的微载体的、对至少一种被分析物具有特异性的 多个捕获抗体接触，以形成多个捕获的被分析物。
[0035] (b)使该多个捕获的被分析物与至少两种类型的对相应的被分析物具有特异性的 检测抗体接触，其中，至少一种类型的检测抗体具有信号放大对的第一成员，以形成多个可 检测的捕获的被分析物；
[0036] (c)使该多个可检测的捕获的被分析物与该信号放大对的第二成员接触，以产生 放大的信号；并且
[0037] (d)检测从该信号放大对的第一和第二成员产生的放大的信号。
[0038] 在该方法的一些实施例中，检测放大的信号是通过使用与光学器件耦合的光学传 感器阵列进行的，其中该传感器是C⑶或C-M0S光传感器。
[0039] 在另一个实施例中，本发明提供一种护理点诊断系统。该系统包括：
[0040] (a)测定装置，该测定装置包括反应室，其中该反应室包括微通道；和
[0041](b)试剂盒，该试剂盒包括：
[0042] i)第一群体的经单独编码的具有功能的微载体，其中该第一群体的经单独编码的 微载体具有附着到其上的第一多个捕获抗体；和
[0043] ii)至少两种类型的检测抗体，该检测抗体包括：
[0044]a)多个用促进部分标记的活化状态非依赖性抗体；和
[0045] b)多个用信号放大对的第一成员标记的活化状态依赖性抗体。
[0046] 在该系统的一些实施例中，该装置包括用于限制该微载体在该微通道的纵向方向 移动同时仍让流体流过的器件。在其他实施例中，该试剂盒还包括第二群体的经单独编码 的微载体，并且该第二群体的经单独编码的微载体具有第二多个捕获抗体。在另一个实施 例中，该第一群体的经单独编码的微载体具有该功能，而该第二群体的经单独编码的微载 体具有不同的功能。
[0047] 在一些方面，该功能是该多个捕获抗体的种类。在其他方面，该功能可通过该编码 鉴别。在一些实施例中，该编码呈该微载体中的穿越孔的构型的形式。
[0048] 在一些实施例中，编码的微载体由选自以下的材料制成：乳胶、聚苯乙烯、交联葡 聚糖、聚甲基苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、氟化乙 烯-丙烯、玻璃、Si02、硅、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯）、金、银、铝、钢和SU-8。在一个实施例 中，编码的微载体由硅制成。
[0049] 在一些实施例中，编码的微载体的功能通过读取该编码来确定。
[0050] 在一些实施例中，编码的微载体被成形为选自以下的成员：球体、薄片体、正方体、 圆盘体、长方体、圆环体、三角体和六角体。在一个实施例中，编码的微载体被成形为薄片 体。
[0051]参考以下【具体实施方式】和附图，本发明的这些和其他目标、特征和优点对本领域 技术人员将变得更加显而易见。
【附图说明】
[0052] 图1显示本发明的一个示例性实施例的结果。图1A显示当使用高浓度（1:500) 的生物素-酪胺（BT-Tyr)时来自BT474细胞裂解物的稀释系列的荧光。图1B显示当使用 低浓度（1:1000)的BT-Tyr时来自BT474细胞裂解物的稀释系列的荧光。
[0053] 图2显示图1B中所示的结果的显微镜照片。图2A显示与低浓度（1:1000)的生 物素-酪胺和75个细胞的样品温育的微载体的照片。图2B显示与低浓度（1:1000)的生 物素-酪胺和7. 5个细胞的样品温育的微载体的照片。
【具体实施方式】
[0054] I.前言
[0055] 本发明提供用于被分析物（如蛋白质生物标志物）的快速鉴别和定量的方法、装 置、用途和试剂盒。在本发明的多重免疫测定法中，将多个捕获抗体附着于编码的微载体以 保持来自例如细胞裂解物的生物标志物。该编码的微载体可用于鉴别该特定的捕获抗体， 从而鉴别该生物标志物，即捕获的被分析物。在某些情况中，本发明提供多重免疫测定法用 于为了诊断目的而鉴别被分析物（例如生物标志物）的体外用途，所述诊断目的例如鉴别 患有疾病的患者，或者鉴别患者是否会对疗法作出响应，或者鉴别要给予患者的药物的适 当剂量。这些目的可通过测量所鉴别的被分析物的表达和/或活化水平来实现。
[0056] 使用本发明，可以快速且准确地诊断医学病症如代谢疾病、脑和认知疾病、胃肠疾 病或癌症，鉴别适当的疗法和优化治疗剂量，这给患者和护理人员提供显著的好处。
[0057] 有利地，本发明的方法、装置、用途和试剂盒促进可在护理点实施的诊断测试，护 理点是这样的场所，在其中可进行实时或接近实时诊断测试，使得所得的测试进行得比没 有采用本发明的系统的类似测试更加有效。护理点诊断测试是在患者护理场所之处或附近 进行的测试，所述场所例如医师的办公室或医院或任何提供医疗护理的地方。测定结果的 快速周转时间提供许多好处，包括基于实时证据作出决定、立即治疗患者、使不必要的测试 减至最少、使副作用减至最少以及成本效益性显著。
[0058] 在某些情况中，本发明的方法和装置使得能够在中央实验室以外，在紧邻患者 的地方进行实验室测试。在某些方面，该方法使用样品和即用型试剂以及一次性测定盒 (assaycartridge)，所述样品为全血、血衆、血清、细针抽吸物（FNA)或脑脊髓液（CSF)。在 某些方面，本发明的装置是便携式的并且使用单独的样品数量。
[0059] II.宙义
[0060] 本文所用的以下术语具有归属于它们的含义，除非另有指明。
[0061] 术语"被分析物"包括任何测定其存在、量和/或种类的目的分子，通常是大分子， 如多肽。在某些情况中，被分析物是实体瘤的或者在脑脊髓液、外周血或血清中的循环细胞 的细胞组分。优选地，被分析物或生物标志物是信号转导分子、病理分子或自身抗体。
[0062] 术语"信号转导分子"或"信号转导物"包括执行细胞将胞外或胞内信号或刺激转 换为响应的过程的蛋白质和其他分子，该过程通常涉及细胞内的有序生化反应次序。信号 转导分子的例子包括但不限于受体酪氨酸激酶如EGFR(例如EGFR/HER-1/ErbBl、HER-2/ Neu/ErbB2、HER-3/ErbB3、HER-4/ErbB4)、VEGFR-l/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/ FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR(例如PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体）、 IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体相关受体）、CSF-1R、FGFR1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA1-8、EPHB1-6、AXL、MER、TYR03、TIE1-2、TEK、RYK、DDR1-2、RET、 c-ROS、V-钙粘蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶）、ALK(间变性淋巴瘤激酶）、ROR1-2、MUSK、 ΑΑΤΥΚ1-3、RTK