Gls1酶在制备肝癌诊断试剂盒中的应用
【专利说明】GLS1酶在制备肝癌诊断试剂盒中的应用
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所属技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，涉及一种GLS1酶的应用，具体地说，涉及GLS1酶在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
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【背景技术】
[0004]肝细胞癌(肝癌)是我国常见的恶性肿瘤。治疗仍以手术为主，但临床上90%的肝癌患者在被诊断为肝癌的时候，已经失去手术机会。而且，肝切除术后5年内复发率高达80%，长期存活率仍然不高。早期诊断是提高术后生存期的最重要的策略。因此，肝癌急需早期诊断和转移复发预测的标记物，提高肝癌的诊断率、手术率、和长期生存时间。
[0005]血清甲胎蛋白AFP升高与肿瘤复发相关，但约有40%的患者AFP为阴性，且与预后无正相关。迄今为止，尚无确定的蛋白标记能够较准确地诊断或预示肿瘤复发转移，也没有评价肝癌预后的指标。因此本领域迫切需要寻找能协助肝癌早期诊断和预测肝癌病情及预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗肝癌及预防肿瘤复发具有重要意义。
[0006]肿瘤细胞为适应其快速增殖的需要对其新陈代谢过程重编程产生了两个重要代谢途径-有氧糖酵解(Aerobic Glycolysis)和谷氨酰胺酵解(Glutaminolysis)。肿瘤细胞即使在氧充足的条件下也将大部分的葡萄糖转化为乳酸，为其快速增殖提供充足的能量。但这也使得进入三羧酸循环(TCA cycle)的丙酮酸比例减少，致使细胞合成代谢的原料和中间产物不充足。为了弥补这种不足，肿瘤细胞产生了一个替代途径来补充这些中间产物，也就是谷氨酰胺酵解(Glutaminolysis)。谷氨酰胺由谷氨酰胺酶(Glutaminase, GLS)水解转变成谷氨酸，并且进一步被谷氨酸脱氣酶(Glutamate dehydrogenase,⑶Η)催化产生α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, a-KG),进入三羧酸循环(TCA cycle),进而维持细胞代谢中间产物的充足，从而形成一个以谷氨酰胺为原料进入三羧酸循环的补充代谢流，称之为谷氨酰胺酵解。谷氨酰胺酶(Glutaminase，GLS)是谷氨酰胺酵解过程的关键限速酶，已有研究表明靶向GLS能够有效的杀伤肿瘤细胞。
[0007]在人类细胞中有两种类型的谷氨酰胺酶，即由2号染色体编码的GLS1和由12号染色体编码的GLS2。GLS1最早发现于肾脏(kidney-type)，随后发现也表达在肿瘤细胞中，如人类B淋巴细胞瘤，乳腺癌，胰腺癌，胶质细胞瘤等肿瘤细胞中GLS1表达量或活性和正常组织相比明显增加，在大鼠和人肝癌(小样本)中也较正常肝细胞高。GLS1基因编码的蛋白有 GAC (Glutaminase C) , KGA (kidney Glutaminase isoform)等。我们研究发现，在肝癌患者肝癌组织切片中GLS1的酶活性显著高于对应的癌旁组织，并且肝癌细胞系中GLS1的酶活性也显著高于正常肝细胞系。上述结果提示，谷氨酰胺酶GLS1酶活性可能是一种潜在的肝细胞癌诊断的生物标记。
[0008]目前，世界上尚未有将谷氨酰胺酶GLS1酶活性检测应用于肝细胞癌诊断的报道。
[0009]
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供GLS1酶的新应用，特别是在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
[0011]本发明提供一种基于GLS1酶活性检测的肝癌早期诊断方法和应用。该方法和应用主要包括:
(1)提供诊断试剂盒临床检测所需的试剂以及可靠操作流程。
[0012](2)临床可疑肝癌病例采取本诊断试剂盒检测，进行诊断和预后评估。
[0013](3)提供一种基于GLS1酶活性检测的肝癌早期诊断标准。
[0014](4)扩大样本量验证肝癌和其他肝脏疾病组织中GLS1酶活性检测的情况。
[0015](5)选择高敏感性GLS1酶活性检测底物。
[0016]本发明包括用于肝癌诊断的GLS1酶活检测试剂盒。
[0017]本发明所述的检测方法，其特异性特征是，所述的样本均来自肝癌病人肝组织中癌组织及远离癌巢的正常组织。
[0018]本发明具有如下的有益效果:
本发明的临床意义是跟踪检测肝脏癌变的发生和病理演变过程中GLS1酶活性变化，预警肝癌发生发展趋势。
[0019]本发明的GLS1与临床上其它癌症标志物，以及影像学检查有显著不同。
[0020]本发明中的GLS1酶活性检测试剂盒为肝癌及其他癌症的基础研究和临床研究提供了良好的工具。
[0021]本发明中提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点，不仅可以在大中型医院推广，也可以在基层医院中广泛使用。
[0022]本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
[0023]【附图说明】:
图1肝癌组织及肝癌细胞中GLS1酶活性检测
活性光谱法检测肝癌组织与对应的癌旁正常组织、肝癌细胞系与正常肝细胞系中GLS1的酶活性。图1A是4组(N0.1-4)肝癌组织(TT)和对应癌旁正常组织(NT)中的GLS1酶活性值。图1B是肝癌细胞系(H印3B，7402, MHCC97-H, Η印G2)和正常肝细胞系(L-02)中的GLS1 酶活性值。* ρ〈0.05，** p<0.01c
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【具体实施方式】
[0025]通过大样本研究(400例肝癌和100余例其他肝疾病)，采用光度法酶活性检测技术，检测GLS1酶活性，诊断肝癌并判断肝癌患者出现复发的风险及术后状况。本发明研究GLS1酶活性与肝细胞癌发生、发展的相关性，以及以GLS1酶活性作为标志物指导肝癌的预后判断。
[0026]具体实施方案如下述实施例及实验例。
[0027]实施例1GLS1的酶活性检测试剂盒本试剂盒是一种用于诊断肝癌的诊断试剂盒，是通过谷氨酰胺酶(GLS1)和谷氨酰胺脱氢酶(GDH)的酶偶联反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)还原后吸光峰值的变化，检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1的酶活性情况，适用于新鲜手术切除组织或-80度冷冻保存的组织。
[0028]1.试剂盒组成
试剂 A:裂解液(NP-40, 1%; Tris-HCl, pH 8.0, 50mM; NaCl, 150mM; PMSF 0.1mM;胃蛋白酶抑制剂1 μΜ;亮抑酶肽0.5 mg/ml;抗蛋白酶肽0.3 μΜ)，XI。
[0029]试剂Β:反应液(57 mMTris-acetate, pH 8.6 ；0.225 mM 乙二胺四乙酸)，XI。
[0030]试剂C:终止液(3M HC1)，X 1。
[0031]试剂D:缓冲液(114 mMTris-HCl, pH 9.4)，XI。
[0032]试剂E:酶促液(0.35 mM腺苷二磷酸，6.3 U/ml谷氨酸脱氢酶，1.7 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，XI。
[0033]试剂F:底物液(1 mM谷氨酰胺)，X 1。
[0034]2.试剂盒保存条件:试剂A、D、E、F保存于-20度，其余试剂保存于4度。
[0035]3.试剂盒使用步骤
3.1组织样本或收集的细胞放在EP管内，加入1ml裂解液(