人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 人肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原 体。主要经飞沫传播而进入呼吸道，从而寄生于人体的鼻咽部，或侵入人体不易清除的部位 引起一系列的疾病，如大叶性肺炎，脑膜炎，支气管炎，中耳炎等。它是全球所有年龄组高发 病率和病死率的主要病原菌。其中，在发展中国家，婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为 严重。肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur)及G.M. Sternberg分别在法 国及美国从患者痰液中分离出。其为革兰氏染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排 列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。其荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌 分型的依据。根据荚膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。其菌体抗原主要 为C多糖，其存在于肺炎链球菌细胞壁中，具有种特异性，为各型菌株所共有。C多糖可被 血清中C-反应蛋白沉淀。在钙离子存在时，C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋白（C reactive protein, CRP)的β球蛋白结合，发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原的检测 亦主要是针对此抗原，而该抗原非肺炎链球菌独有，如缓和链球菌亦含有该抗原。在肺炎 链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原，为肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)，其存在于所 有肺炎链球菌血清型中，是肺炎链球菌的特异性抗原。但是PspA分子结构高度变异，具有 抗原多样性，其富含脯氨酸的结构域上游被称为CDR域，具有多样性。根据CDR域的不同将 PspA 分为 3 个家族 6 亚类：Cladel, Clade2, Clade3, Clade4, Clade5, Clade6。其中 Cladel， Clade2 属于 Faml 家族；Clade3，Clade4，Clade5 属于 Fam2 家族，Clade6 属于 Fam3 家族。 具有Faml或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎链球菌占到了临床分离的人肺炎链球菌种类的 99 %以上。研究表明同一家族亚类间PspA蛋白间存在广泛的抗原抗体交叉反应,而异家族 亚类间则无此交叉反应。
[0003] 临床病人由于不同的呼吸道病原体（如肺炎支原体、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难， 确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明 确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
[0004] 尽管肺炎链球菌在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊 断的标准化商品试剂的种类极少。目前，肺炎链球菌的检测主要有以下几种方法：
[0005] 一、常规实验室检测
[0006] 1、细菌分离
[0007] 实验室诊断肺炎链球菌的金标准是分离人肺炎链球菌毒株。采用鼻咽分泌物作为 病原体分离的标本，可以用血培养的方法分离病原体。但是该法有严重的缺陷，因为肺炎链 球菌是苛养菌，营养要求高，培养所需时间长，阳性率低，更重要的是，若采样前患者使用过 抗菌药物，会造成培养结果的假阳性。这样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。
[0008] 2、血清学检测
[0009] 即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫荧光法等，检测被检者血清中肺炎链球菌抗 体水平，可间接提示肺炎链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊 断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人肺炎链球菌抗体 效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，且因为菌 体血清型种类过多，导致其诱生的抗荚膜多糖抗体种类过多，对抗体的检测造成了很大的 困难，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。
[0010] 二、快速诊断
[0011] 直接检查人肺炎链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有 免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操 作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长（2h以上），成本较高等缺点。PCR方法快速、 灵敏、特异，是目前研究肺炎链球菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求 较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。目前，检测人肺炎链球菌 抗原的方法主要为胶体金法检测其C多糖抗原，但是胶体金法敏感度较低，对待检样品材 料质量要求较高，同时还存在与其他链球菌如缓和链球菌存在交叉反应等缺陷。因此，建立 具备高灵敏度的人肺炎链球菌特异性抗原快速诊断法十分必要。
【发明内容】
[0012] 本发明针对【背景技术】中现存的几种人肺炎链球菌在检测方式中遇到的技术瓶颈， 提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的人肺炎链球菌量子点免 疫层析检测卡及其制备方法和应用。
[0013] 本发明的目的是通过以下技术手段来实现的：
[0014] 一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述人肺炎链球菌量子 点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子 点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相 硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体；所述质控 线包被有抗兔IgG ;所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层 两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置 在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
[0015] 作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS 量子点。
[0016] 作为优选，本发明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0017] 作为优选，本发明所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6. 6-7. 7cm的 底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2. 5-3cm的吸水垫重 叠0. 2-0. 4cm ;所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0. 5-0. 8cm的结合垫重 叠0. 2-0. 4cm ;所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2. 5cm的样品垫重叠0. 2- 0. 4cm ;所述检测线与质控线的间距是0. 5-0. 8cm ;所述底板的宽度是0. 3-0. 5cm。
[0018] 作为优选,本发明所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
[0019] -种基于上述的人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于： 所述制备方法包括以下步骤：
[0020] 1)结合垫的制备：
[0021] I. 1)重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的制备、纯化：
[0022] I. I. 1)对人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白进行生物信息学分析，分别获 取人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到 其对应的基因序列；
[0023] I. 1. 2)在步骤I. I. 1)中所得到的基因序列的5'端及3'端分别引入酶切位点并 分别化学合成全基因序列，同时标记记为PspAl、PspA2 ;其序列参见序列表；
[0024] I. 1. 3)将步骤I. 1. 2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物学方法分别克隆入表 达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重组 PspAl-HiS、PSpA2-His融合蛋白均以可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；
[0025] I. 1. 4)用镍柱纯化步骤I. L 3)所得到的重组PspAl-His、PspA2_His融合蛋白， SDS-PAGE检测其纯度后，再以Bradford法测定蛋白质浓度，调整二种蛋白浓度均为0. 2mg/ mL后备用；
[0026] 1. 2)兔及鼠抗人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0027] 1. 2. 1)以步骤I. L 4)中所得到的重组PspAl-His、PspA2-His融合蛋白为完全抗 原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋 白抗血清及鼠抗人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎链球菌 Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清及鼠抗重组人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗 血清的间接ELISA效价均大于I X IO5 ;
[0028] 1. 2. 2)采用Protein G亲和层析柱分别纯化兔抗人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清及鼠抗人肺炎链球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清中的多克隆抗体 IgG ；
[0029] 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1. 2. 2)所得到的四种多克 隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；
[0030] 1. 3)量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针的制备与纯化：
[0031] 1. 3. 1)向微量离心管中依次加入4nmol量子点、600nmol N-羟基琥珀酰亚胺和 600nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37°C反应 30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分 含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲 液的 pH = 7. 3 ;
[0032] 1. 3. 2)在活化的量子点中，加入4_16nmol的步骤1. 2)所制备的兔抗人肺炎链球 菌Faml PspA蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1. 5%， 封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应Ih ;用0. 2 μ m PES滤器过滤除去抗体聚集物， 然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发 生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶 于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C 下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液中，至 此制得量子点标记的抗人肺炎链球菌Faml PspA蛋白多克隆抗体IgG ;
[0033] 所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢 钠、2g/L氯化钠、5ml/L吐温-20以及lg/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH = 7. 3 ;所述磷 酸盐保存液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、 10g/L BSA以及lg/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH = 7. 3 ;
[0034] 1. 3. 3)按照与步骤1. 3. 1)以及步骤1. 3. 2)相同的方法，利用步骤1. 2)所制备的 兔抗人肺炎链球菌Fam2 PspA蛋白多克隆抗体IgG制得量子点标记的抗人肺炎链球菌Fam2 PspA蛋白多克隆抗体IgG ;
[0035] 1. 3. 4)将上述含量子点标记的抗人肺炎链球菌Faml PspA蛋白多克隆抗体IgG的 溶液与含量子点标记的抗人肺炎链球菌Fam2 PspA蛋白多克隆抗体IgG的溶液按体积比1 : 1混合，即制得量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针，备用；
[0036] 1. 4)量子点标记抗体的负载：
[0037] 将聚酯纤维膜浸入步骤1. 3. 4)所得到的量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针 溶液中lh，取出，25°C干燥后4°C密封保存备用，至此制得结合垫；
[0038] 2)样品垫的制备：
[0039] 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置 于生物安全柜内37°C通风干燥后，25°C密封干燥保存；至此制得样品垫；
[0040] 所述样品垫处理液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢 钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白（BSA)、10ml/L吐温-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯 吡咯烷酮；所述样品垫处理液的pH = 7. 3 ;
[0041] 3)检测层的制备：
[0042] 3. 1)将步骤1. 2. 3)中制备的鼠抗人肺炎链球菌Faml PspA蛋白多克隆抗体