一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物技术，特别涉及一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 胶体金技术是上世纪80年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展 起来的固相标记免疫测定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，但随着生物技术的不断 发展，现在已经出现免疫斑点渗滤以及免疫层析技术等。胶体金免疫层析技术已经广泛应 用于临床诊断，如早孕、乙肝、寄生虫、性病和病毒细菌的检测。该方法最大的特点是价格低 廉、简单快速、特异敏感、不需要任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明 的实验结果。
[0003] 现在市面上应用胶体金免疫层析技术开发出的检测试剂盒绝大部分都是检测某 种抗原或抗体，即他们的检测对象都是蛋白质，应用该技术检测病原体核酸的几乎没有。采 用金标试纸条检测抗原或抗体时，大多采用的是双夹心法免疫测定原理，先将胶体金颗粒 标记在相应病原体抗体或抗原上，检测时若有相应抗原或抗体就会与标金的蛋白结合，结 合物沿硝酸纤维膜向前移动，遇到膜上的包被线时就会形成金标抗体-抗原-抗体复合物 被固定在该检测线上，形成肉眼可见的富集线。这些单纯以检测蛋白为目标的胶体金试纸 条存在很多不足，如所需的大量单克隆抗体昂贵且制备周期长，检测的特异性也不是很高， 在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面也不具有优势。
[0004] 核酸检测技术比起常规的血清学检测具有灵敏度高、特异性强等特点，在缩短检 测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，是对免疫学检测方法的重要补充。
[0005] 目前常用的核酸检测技术是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)。 在临床应用中，通过PCR技术获得的扩增产物最初是通过琼脂糖凝胶电泳的方法根据特条 带的大小来判断阴阳性，这样操作不仅费时、繁琐、容易产生污染，而且只通过扩增产物大 小判断阴阳性特异性也不高。随着分子生物学技术的飞速发展，PCR技术也是日新月异，特 别是焚光定量 PCR( Realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)的发明，给整 个分子诊断行业注入了新的活力。荧光定量PCR技术在临床应用中具有灵敏度高，特异性 强等特点，但该技术对实验人员和仪器设备提出了很高的要求。现在市面上很多荧光定量 PCR检测试剂盒都指定了专门的仪器设备，这些设备价格昂贵，应用单一；同时，试剂盒操 作人员要求有专业的实验技能和知识背景，这样以来，应用荧光定量PCR技术衍生出来的 很多核酸检测试剂盒就很难普及到基层医院，为人民的健康谋福利。
[0006] PCR是变温核酸扩增技术，与PCR不同的是近些年来恒温扩增技术也逐渐发展 应用起来。恒温扩增技术在扩增时所需的温度是不变的，这样就避免了像PCR扩增时 温度的上下大幅度浮动。所以恒温扩增技术也降低了仪器的要求，一般的水浴锅就可 以满足实验条件。这些核酸恒温扩增技术如：依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic Acid Sequence-based Amplification，NASBA)，依赖解旋酶扩增技术（Helicase-dependent Amplification，HDA)，滚环扩增技术（Rolling Circle Amplification，RCA)，环介导等 温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)，转录介导的扩增技术 (Transcription Mediated Amplification，TMA)等。这些技术根据不同的原理在某一特定 的温度条件下(如42 °C )实现特异性核酸DNA或RNA的扩增。无论是采用哪种恒温扩增技术， 扩增产物都需要通过一定的技术手段来实现定性检测。如，有人引入分子信标（molecular beacon)探针实现恒温扩增产物的检测。但是分子信标极不稳定，对溶液离子环境要求特别 高，且分子信标信号的检测也需要高端仪器，不利于普及。
[0007] 如何将胶体金层析技术的快速、操作简单的优点应用于核酸检测？ 1996年，美国 西北大学Mirkin研究组利用纳米金与疏基之间能够形成稳定的Au-S键的性质制备了纳 米金-DNA复合纳米探针，可用于检测DNA，纳米金与巯基形成的Au-S键是牢固的共价键。 Brittany A. Rohrman等人用胶体金免疫层析技术成功的检测了 HIV病毒核酸扩增产物。 他们在实验时，共设计了三种探针，一种探针标记胶体金颗粒，作为特异探针去杂交HIV特 异扩增产物，另外两种核酸探针分别包被在检测线和质控线上，用来捕获HIV核酸扩增产 物---金标核酸探针复合物和游离的金标核酸探针，从而形成T线和C线。这是胶体金检 测核酸的一次成功的例子。但是将核酸探针包被在膜上作为单捕获探针去捕获HIV核酸扩 增产物 金标核酸探针复合物效率并不高，必须借助金显色增强液（gold enhancement solution)来增加显色，提高灵敏度。胶体金在DNA芯片的检测已有相关报道，通常是将 目标分子标记上巯基，因胶体金颗粒的表面包围着一层结合力比较弱的带电配体如柠檬 酸，这些配体分子很容易被结合力强的巯基基团所取代，因而可以将胶体金连接上目标 核酸，然后将标记的目标分子与芯片上的探针杂交实现对其的检测。但这种方法操作繁 琐，且每次杂交均需标记特异的靶标分子，不具备通用性。
【发明内容】
[0008] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测核酸的胶体金标检测试剂 盒，包括： (1) 、通用胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻 璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线(检测线）和C线(质控线)，所述检测线上包被能特异 性结合标记物b的物质，所述质控线上包被能特异性结合标记物a的分子，所述标记物b不 同于标记物a ;通用探针1上标记有胶体金颗粒或同时在另一端标记有标记物a，且固定于 试纸条的玻璃纤维素膜上； (2) 、分别盛有特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：特异探针A系列的一端和待 测核酸杂交，并标记有标记物a，另一端和通用探针1杂交，或当通用探针1既标记有胶体 金颗粒又标记有标记物a时，特异探针A系列不带任何标记，特异探针A系列可以有多种， 如AU A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异探针 B系列一端和待测核酸杂交，另一端标记有标记物b，或者当还包括带有标记物b的通用探 针2时，其同时和通用探针2互补配对杂交，此时特异探针B系列不带任何标记，特异探针 B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，分别装在不同 的探针管里。
[0009] 所述标记物a、b可以为抗原或半抗原，如可以为生物素、地高辛或荧光染料(如 Cy3、Cy5、Fam、Fit等)，则在试纸条上的T线或C线上与它们特异性结合的分子为链霉亲和 素、抗地高辛抗体、相应抗荧光染料抗体。
[0010] 所述通用探针1可以用于所有病原体核酸片段的检测，在设计时必须注重GC%的 比例，尽量避免与金颗粒的一些非特异结合；通用探针1和通用探针2还必须注意和其他 探针结合部分序列的Tm值，尽量提高在较低温度条件下杂交的有效性，经过实验效果的比 较，所公布的通用探针1序列为最优设计序列。所述通用探针1序列为： 5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3 (Seq No. 1)，其中SH为巯基，5'端为巯基修饰，也可进行其他化学基团修饰，如_见12等。
[0011] 本发明提供一种核酸金标快速检测方法，将胶体金免疫层析技术的操作简单、快 速、价格低廉等特点应用到核酸的检测中来。包括如下步骤： (1) 、设计探针：通用探针1、特异探针A系列、特异探针B系列，其中，通用探针1的5' 端巯基化修饰(也可进行其他化学基团修饰，如_册1 2等）后标记胶体金颗粒，或同时在另一 端标记有标记物a ;特异探针A系列，其一端和待测核酸杂交，另一端和通用探针1杂交，标 记有标记物a，或当通用探针1既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a时，特异探针A系列 不带任何标记，特异探针A系列可以有多种，如AU A2……，分别和待测核酸的不同区域互 补配对杂交；特异探针B系列一端和待测核酸杂交，另一端标记有标记物b，或者当试剂盒 还包括带有标记物b的通用探针2时，其同时和通用探针2互补配对杂交，此时特异探针B 系列不带任何标记，特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区 域互补配对杂交； (2) 、制备通用试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃 纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线(检测线）和C线(质控线）;所述检测线上包被抗标记物 b的抗体，能特异性捕获结合标记物b的通用探针2或结合标记物b的特异探针B系列；所 述质控线上包被抗标记物a，能特异性捕获结合标记物a的特异探针A或既标记有胶体金颗 粒又标记有标记