一种从维生素k2包埋剂中提取维生素k2的方法及检测维生素k2的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种从维生素 Κ2包埋剂中提取维生素 Κ2的 方法及检测维生素 Κ2的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素 Κ2,也称为甲萘醌，其结构是由一个甲基萘醌母环和一条位于母环C-3位 置上的异戊二烯侧链组成，根据侧链上异戊二烯单元个数差异，维生素 Κ2共分为14种，以 ΜΚ-η表示，ΜΚ-7即侧链上含有7个异戊二烯单元。维生素 Κ2具有促进凝血、防治骨质疏 松、改善动脉硬化、防治肝癌和白血病等药理活性。
[0003] 维生素 Κ2遇碱和见光均不稳定，容易分解，而耐热、耐酸。复方制剂中维生素 Κ2 通过微囊包埋技术增加稳定性。微囊包埋膜是高分子材料，而维生素 Κ2是脂溶性维生素， 提取维生素 Κ2必需用有机溶剂，但是有机溶剂不能溶解高分子微囊包埋膜，加之维生素 Κ2 不稳定，从而造成维生素 Κ2含量测定难度很大；因此，目前已报道文献的方法均不能测定 微囊包埋的维生素 Κ2。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供一种从维生素 Κ2包埋剂中提取维生素 Κ2的方法及检测维 生素 Κ2的方法。本发明建立了反相高效液相色谱法测定微囊包埋的维生素 Κ2,为维生素 Κ2复方制剂的质量标准提供依据。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种从维生素 Κ2包埋剂中提取维生素 Κ2的方法，包括如下步骤：
[0007] 步骤1 :取所述维生素 Κ2包埋剂与酸混合后超声；
[0008] 步骤2 :取步骤1的产物与有机溶剂混合后超声；
[0009] 步骤3 :取步骤2的产物与有机溶剂混合。
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，以g/mmol计，所述维生素 Κ2包埋剂与酸的质量 摩尔比为（0. 5~1) :(1~3)。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤1或步骤2中所述超声的时间为5~ 15min〇
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酸的浓度为2~4mol/L。
[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤2或步骤3中的所述有机溶剂包括无水乙 醇或乙酸乙酯中的一种或两种。步骤2或步骤3中的所述有机溶剂可以相同也可以不相同。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，以g/mL计，维生素 K2包埋剂与步骤2中所述有 机溶剂的质量体积比为（〇. 5~1) : (10~15)。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述有机溶剂的添加量为定容止容量 瓶刻度线为准。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，与有机溶剂混合后还包括过滤、纯化的步骤。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，所述纯化为经高效液相色谱纯化；所述高效液 相色谱的流动相为异丙醇、甲醇和0. 1% (V/V)乙酸溶液；所述异丙醇、甲醇和0. 1 %乙酸溶 液的体积比为（400~500) : (450~500) : (15~30)。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述高效液相色谱的流速为0. 8~ I. 2mL/min〇
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述高效液相色谱的的柱温为35~ 40 cC 〇
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤1或步骤2中所述超声的频率为45khz、所 述超声的功率lkw。
[0021] 具体的，本发明提供的从维生素 K2包埋剂中提取维生素 K2的方法为：精密称 取0. 5-lg样品，置于25-50ml棕色容量瓶，加入2-4mol/L的酸溶液l-3ml，摇匀，超声 (频率为45khz、功率lkw) 5_15min，加入10~15mL无水乙醇，超声（频率为45khz、功率 lkw) 5-15min，放冷，用无水乙醇定容至刻度，摇勾，经0. 45 μ m的滤膜过滤，即得供试液。
[0022] 具体的，本发明提供的从维生素 K2包埋剂中提取维生素 K2的方法为：精密称取 〇. 5g样品，置于25ml棕色容量瓶，加入3. 2mol/L的盐酸溶液2. 00ml，摇匀，超声（频率为 45khz、功率lkw) lOmin，加入10~1 SmT,无水乙醇，超声（频率为45khz、功率lkw) 5min，放 冷，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，经0. 45 μ m的滤膜过滤，即得供试液。
[0023] 本发明还提供了一种检测维生素 K2包埋剂中维生素 K2的方法，包括如下步骤：
[0024] 步骤1 :根据上述方法从维生素 K2包埋剂中提取维生素 K2 ;
[0025] 步骤2 :获得维生素 K2包埋剂中维生素 K2的含量。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，获得维生素 K2包埋剂中维生素 K2的含量的方 法为经紫外检测器检测，并用外标法定量。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，维生素 K2包埋剂中维生素 K2的含量计算公式 为：
[0028] X = CXV/MXK
[0029] 式中：X-样品维生素 K2的含量，mg/100g ;
[0030] M-样品的质量，g ;
[0031] K一单位转换系数（K = 100);
[0032] V-样品的稀释倍数，ml ;
[0033] C-样品溶液中维生素 K2的浓度，mg/ml。
[0034] 本发明提供了一种从维生素 K2包埋剂中提取维生素 K2的方法，取所述维生素 K2 包埋剂与酸混合后经超声，再与有机溶剂混合后超声后，与有机溶剂混合。本发明通过对维 生素 K2的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率 试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效， 能对维生素 K2复方制剂（包埋）的维生素 K2含量起到质量控制的目的。
【附图说明】
[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0036] 图1~图5示实施例7对照储备液的液相色谱图；分别对应实施例7中序号 WieSTDl ~STD5 ;
[0037] 图6示标准曲线；
[0038] 图7~图12示实施例8精密度试验谱图；分别对应测定次数1~6 ;
[0039] 图13~图18示实施例9重复性试验谱图；分别对应序号1~6份样品；
[0040] 图19~图24示实施例10稳定性试验谱图；分别对应0h、lh、2h、4h、8h、12h ;
[0041] 图25~图26示实施例11空白试验谱图；其中图25示空白色谱图，图26示对照 色谱图；
[0042] 图27~图35示实施例13回收率试验谱图；分别对应序号为1~9加标回收实 验；
[0043] 图36示实施例12的检出限谱图；
[0044] 图37示实施例12的定量限谱图。
【具体实施方式】
[0045] 本发明公开了一种从维生素 K2包埋剂中提取维生素 K2的方法及检测维生素 K2 的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应 用本发明技术。色谱条件：
[0046] 流动相：异丙醇：甲醇：0. 1 %乙酸溶液=(400-500:450-500:15-30)，优选 (500:475:25)
[0047] 流速：0· 8-1. 2ml/min，优选 1.0 ml/min
[0048] 波长：270nm
[0049] 柱温：35-40 Γ，优选 40 Γ
[0050] 进样量：20 μ L
[0051] 色谱柱：只要是(：18柱都可以，优选厶81161^38-(：18,4.6\250臟，5 4111
[0052] 对照储备液的配制：
[0053] 精密称取维生素 Κ2对照品5. 91mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入1.0 Oml四氢呋 喃溶解，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在_18°C的冰箱中避光储存备 用。
[0054] 标准工作曲线绘制：
[0055] 分别精密移取储备液 0· 10ml、0. 25ml、0. 50ml、l. 00ml、l. 50ml 于 50ml 容量瓶中， 用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得工作标准液。
[0056] 试样制备：
[0057] 精密称取0. 5-lg样品，置于25-50ml棕色容量瓶，加入2-4mol/L的酸溶液l-3ml， 摇勾，超声5_15min，加入10~15mL无水乙醇，超声5_15min，放冷，用无水乙醇定容至刻 度，摇匀，经0. 45 μ m的滤膜过滤，即得供试液。
[0058] 结果计算：
[0059] X = CXV/MXK
[0060] 式中：X-样品维生素 K2的含量，mg/100g ;
[0061] M-样品的质量，g;
[0062] K一单位转换系数（K = 100);
[0063] V-样品的稀释倍数，ml ;
[0064] C一样品溶液中维生素 K2的浓度，mg/ml。
[0065] 本发明提供的一种从维生素 K2包埋剂中提取维生素 K2的方法及检测维生素 K2 的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0066] 试样中的维生素 K2用酸溶液破坏包埋膜，用无水乙醇提取，用高效液相色谱C18 柱将维生素 K2分离，经紫外检测器检测，并用外标法定量。
[0067] 仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪。
[0068] 试剂试药：无水乙醇（AR);浓盐酸（AR);乙酸（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；异丙醇 (色谱纯）；一级用水。
[0069] 维生素 K2 对照品来源：Kappa Bioscience 批号：A21400163 纯度：100%。
[0070] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0071] 实施例1色谱条件
[0072] 流动相：异丙醇：甲醇：0. 1 %乙酸溶液=(500:475:25)
[0073] 流速：1.0ml/min
[0074] 波长：270nm
[0075] 柱温：40°C 进样量：20 μ L
[0076] 色谱柱：Agilent SB-C18, 4. 6X250mm，5 μπι
[0077] 实施例2色谱条件
[0078] 流动相：异丙醇：甲醇：0. 1 %乙酸溶液=(400:450:30)
[0079] 流速：0· 8ml/min 波长：270nm
[0080] 柱温：35 °C 进样量：20 μ L
[0081] 色谱柱：Agilent SB-C18, 4. 6X250mm，5 μπι
[0082] 实施例3色谱条件
[0083] 流动相：异丙醇：甲醇：0. 1 %乙酸溶液=(450:500:15)
[0084] 流速：1. 2ml/min 波长：270nm
[0085] 柱温：38 °C 进样量：20 μ L
[0086] 色谱柱：Agilent SB-C18, 4. 6X250mm，5 μπι
[0087] 实施例4制剂的配制
[0088] 对照储备液的配制：
[0089] 精密称取维生素 Κ2对照品5. 91mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入1.0 Oml四氢呋 喃溶解，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在_18°C的冰箱中避光储存备 用。
[0090] 标准工作曲线绘制：
[0091] 分别精密移取储备液 0· 10ml、0. 25ml、0. 50ml、l. 00ml、l. 50ml 于 50ml 容量瓶中， 用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得工作标准液。
[0092] 试样制备：
[0093] 精密称取0. 5g样品，置于25ml棕色容量瓶，加入3. 2mol/L的盐酸溶液2. 00ml，摇 勾，超声l〇min，加入10~15mL无水乙醇，超声5min，放冷，用无水乙醇定容至刻度，摇勾， 经0. 45 μ m的滤膜过滤，即得供试液。
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