基于部分还原氧化石墨烯的dna荧光检测方法及其试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA荧光检测方法及其试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。
【背景技术】
[0002]氧化石墨稀是一种性能优异的新型碳纳米材料，具有较高的比表面积和丰富的表面官能团，其理想的晶格结构和独特的光学、表面、机械、电学及热学性质在生物和化学传感器、储能器件及复合材料等诸多领域都具有良好的应用前景。
[0003]荧光共振能量转移是能量由供体荧光团经无辐射途径转移给受体荧光团，并引起供体荧光猝灭和受体荧光增强的光学现象。近年来，人们致力于开发基于氧化石墨烯荧光淬灭效应的荧光共振能量转移传感器，并将其用于生物及化学检测。研究表明，由于氧化石墨烯的结构特点，其对带有裸露的环状结构的化合物具有强烈的吸附能力。单链DNA(ssDNA)中的碱基包含六元环结构，氧化石墨烯会与裸露的碱基发生强烈的JT-JT相互作用、疏水作用等，从而吸附ssDNA。而在双链DNA (dsDNA)中磷酸骨架将碱基有效屏蔽在其中，使氧化石墨稀无法与碱基接触，从而造成结合能力的减弱。利用氧化石墨稀结合不同分子结构的DNA能力的差异，以氧化石墨烯作为荧光共振能量转移纳米探针，可以测定特定序列的DNA含量。
[0004]本发明提供了一种基于部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA荧光检测方法及其试剂盒。部分还原氧化石墨烯通过氧化石墨烯在碱性溶液中的室温控制还原得到，在保持水溶液体系稳定性的基础上，有效增加了 sp2杂化晶域，对荧光分子修饰ssDNA的荧光猝灭效率和猝灭速度均大幅度提高。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种基于部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA检测方法。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供部分还原氧化石墨烯(a液)，探针链DNA溶液(b液)。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:本发明所述的一种基于部分还原的氧化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是将6-羧基荧光素标记单链DNA与目标链DNA加入到Tris-HCl缓冲液中，杂交反应后加入部分还原氧化石墨稀，室温反应，测定520 nm处的荧光强度，激发波长为494 nm;所使用的部分还原氧化石墨烯由以下方法制备而得:将4 mg/mL氧化石墨烯水溶液与10 mmol/L NaOH水溶液等体积混合，将混合物在室温条件下搅拌反应后所得的悬浮液离心分离，并用纯净水洗涤至中性，干燥，获得的沉淀物为部分还原氧化石墨稀。
[0008]所述的部分还原氧化石墨烯对6-羧基荧光素标记单链DNA的荧光猝灭率为99.3%。
[0009]将40 mL 500 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA与40 mL目标链DNA加入到405mL 浓度为 10 mmol/L 的 pH 为 8.0 且含 50 mmol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA 的 Tris-HCl 缓冲液中，37 °C条件下杂交30分钟，加入15 mL 100 mg/mL部分还原氧化石墨稀，室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度，激发波长为494 nm。
[0010]上述的目标链DNA检测线性范围为0.2-40 nmol/L，检测限为50 pmol/L。
[0011]本发明所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，其特征是试剂盒包括a液和b液；a液为部分还原氧化石墨烯溶液，b液为含探针链FAM-ssDNA的Tris-HCl缓冲液。
[0012]上述的a液为浓度为100 mg/mL的部分还原氧化石墨稀水溶液。
[0013]上述的b 液为含 44.94 nmol/L 探针链 FAM-ssDNA 的 10 mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液，所述的 Tris-HCl 缓冲液其 pH 为 8.0，且含 50 mmol/L NaCl 和 lmmol/L EDTA。
[0014]本发明所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒的使用方法为:40 mL目标链DNA加入到445 mL b液中，混合后在37 °(:条件下杂交反应30分钟，在混合溶液中加入15 mL a液，混合后室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度F，激发波长为494 nmD
[0015]上述的目标链DNA检测线性范围为0.2-40 nmol/L，检测限为50 pmol/L。
[0016]所述的方法，能区分单碱基错配DNA和目标链DNA。
[0017]本发明采用的技术方案为:
(一)氧化石墨烯的制备
氧化石墨烯的制备:称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0 °C冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0 °C冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35 °(:温水浴中，控温1小时，然后再将混悬液转移至50 °(:温水浴中，控温12小时。将一定量的冰水混合物缓慢加入到得到的紫黑色混悬液中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗(孔径20-30微米)过滤，继而4000转/分钟离心30分钟，分别经过水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗(孔径1.5-2.5微米)过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨烯固体。
[0018](二)部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的制备
将4 mg/mL上述方法制备的氧化石墨稀水溶液与10 mmol/L的NaOH水溶液等体积混合，室温条件下搅拌反应2小时，12000转/分钟离心30分钟，并用水洗涤至中性。最后置于恒温干燥箱50 °C干燥12小时，得到部分还原氧化石墨烯固体。
[0019](三)DNA检测
将40 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA(FAM-ssDNA)与不同浓度目标链DNA混合，37°C条件下杂交30分钟，杂交缓冲液为10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA)。加入3 mg/mL部分还原氧化石墨稀，反应30秒，用焚光分光光度计检测荧光(激发波长494 nm)。
[0020]为了实现上述试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案:
(四)试剂盒组成
a液包括上述技术方案(二)制备的部分还原氧化石墨烯加入超纯水超声分散所形成的溶液，其浓度为100 mg/mLo b液为含44.94 nmol/L探针链DNA的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，含 50 mmol/L NaCl 和 lmmol/L EDTA)。
[0021](五)试剂盒使用方法
将目标链DNA 40 mL加入到445 mL技术方案(四)的b液，混合后37 °C杂交30分钟。加入15 mL技术方案(四)的a液，混合后室温条件下反应30秒，立即用494 nm激发波长检测其520 nm处荧光强度(F)。以F (含有目标链DNA)与F。(空白)的差值(F- F。)对目标链DNA绘制标准曲线进行定量。荧光分光光度法测定的检测限为50 pmol/L ο
[0022]本发明的优点:
(1)本发明使用部分还原的氧化石墨烯为探针，吸附单链DNA能力强，用量少，反应迅速等特点。
[0023](2)本发明使用的部分还原的氧化石墨烯纳米材料其本身具有良好的水溶性，荧光背景低等性质，不需要任何前修饰步骤。
[0024](3)本发明在检测DNA中测定灵敏度高，DNA检测限为50 pmol/L。
[0025](4)本发明检测DNA选择性好，能有效区分单碱基错配和非互补DNA序列。
【附图说明】
[0026]图1为氧化石墨烯、部分还原氧化石墨烯与FAM-ssDNA作用的荧光光谱图。
[0027]图2为部分还原氧化石墨烯对FAM-ssDNA的猝灭动力学曲线。
[0028]图3为检测不同浓度目标DNA时的荧光光谱图。
[0029]图4为目标DNA的标准曲线。
[0030]图5为DNA检测特异性图。
【具体实施方式】
[0031]本发明的一个方面在于提供一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测方法。以下结合附图及若干实施例对本发明检测方法的技术方案作进一步的说明。
[0032]实例1:
称取325目鳞片石墨2.7 g，加入到316 mL浓度为18.4 mol/L的浓硫酸和36 mL浓度为14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0 °(:冰浴中。将16.2 g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0 °C冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35 °(:温水浴中，控温1小时，然后将所得墨绿混悬液转移至50 °C温水浴中，控温12小时。360 mL冰水缓慢加入到得到的紫黑色混悬液混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，搅拌30分钟。所得溶液经G1砂芯漏斗(孔径20-30微米)过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入180 mL超纯水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入180 mL 30wt%盐酸充分振荡洗涤，经G