一种基于拉曼信标分子编码银金核壳纳米粒子的真菌毒素双重检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明建立一种基于拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子的真菌毒素双重检 测方法，属于材料化学应用领域。
【背景技术】
[0002] 真菌毒素是有害微生物释放出的有毒次级代谢产物，具有致癌，致突变和肝毒性， 其中髓曲霉毒素和黄曲霉毒素是谷物样品中最常见的真菌毒素。目前常用的检测技术主要 包括色谱法、巧光分析和免疫分析等，然而色谱法设备昂贵，需要专业操作人员，且方法耗 时，因此限制了色谱法的应用；巧光信号易受氧气、湿度和外来物品干扰，影响检测的准确 性；免疫分析则依赖于抗原抗体特异性亲和，抗体分子不稳定，且该方法的实验操作复杂繁 琐。相比之下，适配体传感器具有良好的特异性和简便的操作性，在真菌毒素的检测中具有 很大潜力。髓曲霉毒素和黄曲霉毒素适配体已被相继报道，且对目标分子表现出良好的生 物亲和性。尽管适配体传感器的检测灵敏度可W达到皮克甚至飞克水平，但大部分仍需要 借助于核酸扩增技术。扩增技术的引入需要额外复杂的操作，同时且会导致假阳性结果，所 W急需建立一种准确、灵敏、无核酸扩增的真菌毒素检测方法。
[0003] 表面增强拉曼已成为一种灵敏的检测技术，拉曼纳米组装体已被成功应用于核 酸、癌症标记物、蛋白质和重金属离子的检测。纳米组装体的拉曼信号主要依赖于在两个或 多个相邻的金属纳米颗粒间隙的等离子禪合。然而髓曲霉毒素和黄曲霉毒素的适配体长度 较长，会在纳米粒子之间产生一个很大的间隙，从而产生微弱的拉曼信号，不利于提高检测 的灵敏度。而将拉曼信标分子嵌入在核和壳的交界处，则会显著放大信标分子的拉曼信号， 从而不用精确控制相邻纳米颗粒之间的间隙尺寸。因此制备多重、信号强拉曼编码粒子可 W实现快速、高通量地真菌毒素检测。
[0004] 双金属等离子的核和壳组成的拉曼编码粒子表现出独特的局部表面等离子体共 振效应，和其他纳米粒子相比，银具有最好的等离子增强效应，而金良好的生物相容性可W 作为银核的外部壳层W防止银的氧化和毒性，提高了纳米粒子的整体稳定性。然而，当银 核与氯金酸溶液混合时会瞬间发生置换反应，形成中空的金纳米粒子或者纳米笼。因此本 专利制备两种拉曼信标分子编码的银核金壳实屯、结构纳米颗粒，确保了银核和金壳间较强 等离子禪合作用，大大提高拉曼信标分子的拉曼信号，应用于髓曲霉毒素和黄曲霉毒素超 灵敏的双重检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于拉曼信标分子编码银@金核壳结构纳米粒子的真 菌毒素双重检测方法。
[0006] 本发明的技术方案包括：拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子的制备及表征， 双重检测拉曼传感器的构建W及在黄曲霉毒素和髓曲霉毒素的特异性分析检测。
[0007] 具体步骤：
[0008] (1)拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子的制备
[0009] 采用棚氨化钢还原法制备粒径大小为lOnm的银纳米粒子，在已合成的银纳米粒 子表面修饰拉曼信标分子，然后进行一层金壳的生长，通过调控缓冲体系的抑和拉曼信标 分子的种类制备不同拉曼信标分子编码的银@金核壳纳米粒子。
[0010] (2)双重检测拉曼传感器的构建
[0011] 在已制备的两种不同种类的拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子分别修饰表 面分别修饰黄曲霉毒素和髓曲霉毒素的核酸适配体。参照专利化2009 1 0182031. 2合成 粒径大小在240nm左右磁性纳米粒子，在其表面修饰黄曲霉毒素和髓曲霉毒素核酸适配体 的互补核酸片段。通过核酸杂交互补配对原则，拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子组 装在磁纳米粒子周围，该结构表现出较强的拉曼信号。
[0012] (3)黄曲霉毒素和髓曲霉毒素的特异性分析检测
[0013] 在已构建好的双重检测拉曼传感体系中加入不同浓度的黄曲霉毒素和髓曲霉毒 素，相应的银@金核壳纳米粒子表面的核酸适配体和目标分子识别，使得对应的拉曼分子 编码银@金核壳纳米粒子从磁性纳米粒子表面脱落，通过磁分离，组装体的拉曼信号减弱， 建立组装体拉曼信号强度和对应真菌毒素浓度间的标准曲线。
[0014] 本发明的有益效果：本发明提供一种简便、可控的方法制备多种拉曼信标分子编 码银@金核壳纳米粒子，构建新型多重拉曼传感检测器，实现两种甚至多种真菌毒素的同 时、快速、特异性检测。
【附图说明】
[0015] 图1拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子的透射电子显微镜照片
[0016] 图2两种拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子的拉曼图谱
[0017] 图3磁纳米粒子-拉曼信标分子编码银@金纳米粒子的核-卫星状组装体的透射 电子显微镜照片
[0018] 图4不同浓度黄曲霉毒素和髓曲霉毒素下纳米组装体的拉曼图
【具体实施方式】[001引实施例1
[0020] (1)对氨基苯硫酪编码银@金核壳纳米粒子的制备
[0021] 采用棚氨化钢还原法制备粒径大小为lOnm的银纳米粒子，取2mL的银纳米粒子W 8000转每分钟的速度离屯、lOmin，去除上清液，将沉淀重悬在200μL超纯水中。取100μL 的银纳米粒子，加入2μL100μΜ对氨基苯硫酪，使其终浓度为2μΜ。在室溫下反应12h，W 8000转每分钟的速度离屯、lOmin，去除未修饰的对氨基苯硫酪，将沉淀重悬在100μL超纯 水中。
[002引取新鲜配置的100μLlOOmM的巧樣酸溶液加入到1血质量分数为1 %的聚乙締 化咯烧酬溶液，混合均匀。用浓度200mM的氨氧化钢溶液调节溶液pH为9. 5,然后将50μL 对氨基苯硫酪修饰的银纳米粒子和100μL浓度为2mM的氯金酸溶液加入到上述溶液中，室 溫反应化，离屯、去除上清液，将沉淀分散在50μL的超纯水中，即制备好的对氨基苯硫酪编 码银@金核壳纳米粒子。
[0023] (2)对硝基苯硫酪编码银@金核壳纳米粒子的制备
[0024] 采用棚氨化钢还原法制备粒径大小为lOnm的银纳米粒子，取2mL的银纳米粒子W 8000转每分钟的速度离屯、lOmin，去除上清液，将沉淀重悬在200μL超纯水中。取100μL 的银纳米粒子，加入2μL100μΜ对硝基苯硫酪，使其终浓度为2μΜ。在室溫反应12h，W 8000转每分钟的速度离屯、lOmin，去除未修饰的对硝基苯硫酪，将沉淀重悬在100μL超纯 水中。
[002引取新鲜配置的100μLlOOmM的巧樣酸溶液加入到1血质量分数为1 %的聚乙締 化咯烧酬溶液，混合均匀。用浓度200mM的氨氧化钢溶液调节溶液pH为9. 5,然后将50μL 对硝基苯硫酪修饰的银纳米粒子和100μL浓度为2mM的氯金酸溶液加入到上述溶液中，室 溫反应3h，离屯、去除上清液，将沉淀分散在50μL的超纯水中，即制备好的对硝基苯硫酪编 码银@金核壳纳米粒子。
[0026] (3)拉曼信标分子编码银@金核壳纳米粒子的表面修饰
[0027] 取50μL200ηΜ已制备的对氨基苯硫酪编码银@金核壳纳米粒子分散在500μL Tris-棚酸溶液中，加入5μL10μΜ髓曲霉毒素核酸适配体，反应1化后，将溶液W8000转 每分钟的速度离屯、lOmin，去除上清液，将沉淀重悬在50μL超纯水中。
[0028] 取50μL200ηΜ已制备的对硝基苯硫酪编码银@金核壳纳米粒子分散在500μL Tris-棚酸溶液中，加入5μL10μΜ黄曲霉毒素核酸适配体，反应1化后，将溶液W8000转 每分钟的速度离屯、lOmin，去除上清液，将沉淀重悬在50μL超纯水中。
[0029] (4)双重检测拉曼传感器的构建
[0030] 参照专利化200910182031. 2合成粒径大小在240皿左右簇基化的磁性纳米粒 子。取100μL500ηΜ磁性纳米粒子加入50μL100μΜ1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐溶液和50μL10μΜN-径基班巧酷亚胺溶液，室溫下解育过夜。取10μL 500ηΜ已活化好的磁性纳米粒子加入到1血抑7. 4憐酸盐缓冲溶液中，混合均匀，加入 2. 5μL100μΜ黄曲霉毒素核酸适配体的互补片段和2.5μL100μΜ髓曲霉毒素核酸适配 体的互补片段，混合物于室溫下震荡反应lOh，磁分离，用乙醇洗涂Ξ次，将沉淀重悬在超纯 水中。
[0031] 取20μLlOnM已修饰好核酸片段的磁性纳米粒子、20μL200nM髓曲霉毒素核酸 适配体修饰的对氨基苯硫酪编码银@金核壳纳米粒子、20μL200nM黄曲霉毒素核酸适配 体修饰的对硝基苯硫酪编码银@金核壳纳米粒子加入到100μLTris-盐酸缓冲溶液中，在 40°C下解育化，通过DNA杂交互补配对原则，