一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中10种抗生素的方法
【专利说明】一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中?ο种抗 生素的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及测定水中微量有机污染物的检测方法，特别地提供一种新的样品前处 理方式和灵敏的检测方式，具体来说是样品前处理技术结合液质联用技术直接测定水样中 10种常见抗生素的含量，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。 【【背景技术】】
[0002] 抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似 物，主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，为人类健康事业作出了巨大贡 献。但是，近年来抗生素滥用现象十分严重，卫生部曾表示，在中国，患者抗生素的使用率达 到70%，是欧美国家的两倍，但真正需要使用的不到20%。此外，抗生素的滥用除了体现在 医药行业外，也体现在畜牧业、水产养殖业及工业上。
[0003] 抗生素的滥用给我国地表水造成了严重的污染。有报道称，已有68种抗生素在我 国的地表水环境中被检出，而且被检出抗生素的总体浓度水平与检出频率均较高，其中一 些抗生素在珠江、黄浦江等地的检出频率高达100%，有些抗生素检出的浓度高达每升几百 纳克，工业发达的国家则小于20纳克。这些在水环境中长期存在的抗生素会诱导微生物的 耐药性，并最终通过食物链对人类健康构成潜在威胁，控制水环境中的抗生素已刻不容缓。
[0004] 样品的前处理是关系到分析结果准确性的关键步骤，有调查显示在整个色谱分析 过程中，30%的误差来源于样品前处理。由此可见，要保证分析结果的准确性，必须从样品 前处理技术入手。随着人们对于水环境中抗生素问题的日益重视，有关水环境中抗生素残 留检测的专利和论文已有公开发表。例如中国专利公开号CN101639466A公开了一种测定 水环境中磺胺和抗生素的SPE-HPLC方法；中国专利公开号CN101696964A公开了一种针对 水环境中氟喹诺酮的SPE-HPLC-荧光方法；中国专利公开号CN103336080A公开了一种测定 水环境中四环素的HLB-HPLC-MS/MS方法；中国专利公开号CN103278587A公开了一种针对 水环境中头孢的HLB-HPLC-MS方法等，这些方法的前处理方式主要是以固相萃取为主。水 环境中物染污物的种类多，存在形态各异，浓度较低而且环境基质比较复杂，采取固相萃取 为前处理方式，可以去除不需要的杂质，降低基质效应。但是，经固相萃取后，样品中待测物 的浓度在一定程度上会被稀释，这在一定程度上限制了其使用。
[0005] 分散液液微萃取（DLLME)是由Rezaee等人于2006年首次提出的前处理方法，具 有操作简单，有机试剂用量少，富集倍数大等优点，但是其不适用于环境等复杂基质。
[0006] 随着水安全标准的日益提高，对于能够快速、灵敏、准确地测定水源中尽可能多的 抗生素残留存在迫切需要，也是目前水环境领域中深入研究的重点课题之一。超高效液相 色谱-质谱法（UPLC-MS/MS)是21世纪初发展起来的一种分析技术，它是一种结合了UPLC 的高效分离能力与MS/MS的高灵敏度和极强专属性的分离检测技术，具有应用范围广、分 离能力强、灵敏度高、分析速度快和自动化程度高等特点，目前已成为有机物分析，特别是 药物分析的重要方法之一。 【
【发明内容】
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[0007] 本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种同时测定水环境（饮用水、自来 水、河水、污水处理厂进出水）中10种不同结构抗生素的方法。本发明采用固相萃取结合分 散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，并利用超高液相色谱-质谱连用为检测器， 克服了现有方法有机试剂消耗大、干扰多以及检测限等问题，能够快速检测水环境中磺胺 嘧啶、磺胺甲恶唑、霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和 替硝唑10种抗生素的含量，适用对象广，测定结果灵敏，准确，干扰少。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] -种分离富集并同时检测水环境中10种抗生素的方法，其具体步骤如下：
[0010] 固相萃取-液液微萃取分离富集条件的优化
[0011] 选择环境中常见的抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环 丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯、替硝唑），采用单因素试验，对SPE-DLLME水中残 留抗生素进行条件考察，包括固相萃取小柱的种类、固相萃取pH值、洗脱剂种类、分散液液 微萃取萃取剂和分散剂的种类和用量等，选择最优的条件，得到在最优条件下对抗生素的 最大萃取率；
[0012] 本发明包括如下步骤：
[0013] (1)水样的预处理
[0014] 采集、过滤后的水样加入金属螯合剂Na2-EDTA，用稀盐酸调节pH至3. 0-4. 0 ;
[0015] (2)固相萃取（SPE)富集浓缩过程
[0016] 依次用甲醇和等体积的纯水活化固相萃取小柱，将预步骤（1)中处理过的水样过 柱，富集，纯水淋洗，甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干，得残渣备用；
[0017] (3)液液微萃取（DLLME)富集浓缩过程
[0018] 将步骤（2)中得到的残渣用甲醇溶解，往该样品加入用稀盐酸调节的pH为 3. 0-4. 0的纯水，再分别加入二氯甲烷和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈，涡旋，超声，离 心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用。
[0019] (4)超高液相-质谱联用测定水环境中10种抗生素
[0020] 超高液相色谱分离
[0021] 有机相为乙腈（B)，水相为体积比为0. 1%的甲酸水溶液（A)，采取梯度洗脱程序， 其梯度洗脱程序为〇_5min，流动相乙腈与0. 1 %甲酸-水的比例从30:70,改变为70:30;流 速为0· 2mL·min\柱温为35°C。
[0022] 质谱检测
[0023] 离子源为电喷雾离子化源（ESI源），源温度为120°C，锥孔电压：30V，提取离子电 压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350°C，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间： 0.ls，检测方式选择多反应离子检测（MRM);
[0024] 精密量取乙腈-水（35:65)溶液100μL溶解步骤⑶中的残渣，涡旋后，用 0. 45μm滤膜过滤，得供试品，进样量10μL。
[0025] 其中，步骤（1)中水样体积（mL)与金属螯合剂Na2-EDTA的用量（g)为：1000:1， 取水样250-500mL，加入螯合剂Na2-EDTA(0.lg/100mL水），所述的酸为稀盐酸；
[0026] 步骤（2)中固相萃取小柱为聚合物填料萃取小柱，活化固相萃取小柱的甲醇和纯 化水的用量为：小柱体积的1-2倍，洗脱用甲醇的用量为：小柱体积的1-2倍；
[0027] 步骤⑶中二氯甲烧、甲醇-乙腈（1:1)的用量分别为：700-900μL和 1100-1300yL；
[0028] 祸旋时间：l_2min超声时间：4_6min离心转速：3000-5000rpm离心时间：5_8min
[0029] 具体地，本发明可以采用如下方法制备：
[0030] (1)水样的预处理
[0031] 水样采集后封装冷冻，临用前解冻，过滤，其过滤方式为依次经双层定量滤纸过滤 1-4遍（根据水样洁净程度），0. 45μm滤膜过滤1遍；定量取过滤后的水样250-500mL，加 入金属螯合剂Na2-EDTA(0.lg/100mL水），用稀盐酸调节pH至3. 0-4. 0;
[0032] (2)固相萃取（SPE)富集浓缩过程
[0033] 依次用小柱体积1-2倍体积的甲醇和等体积的纯水活化聚合物填料萃取小柱， 将预步骤（1)中处理过的水样以5-10mL·min1过柱，富集完成后用小柱体积的1-2倍的 纯水淋洗并将小柱置于真空状态下干燥l〇min后，用小柱体积的1-2倍的甲醇以流速为 1.OmL·min1洗脱目标待测物，接收容器为的具塞玻璃离心管，洗脱液在30-35Γ水浴条件 下，用氮气吹干，得残渣备用。
[0034] (3)液液微萃取（DLLME)富集浓缩过程
[0035] 将步骤（2)中得到的残渣用50yL甲醇溶解，往该样品中加入用稀盐酸调节后pH 为3. 0-4. 0的水5mL，再分别加入萃取剂二氯甲烷700-900μL和体积比为1:1的分散剂甲 醇-乙臆 1100-1300μL，祸旋l_2min，超声 4_6min，在 3000-5000rpm下离心 5_8min，去除 上层水，下