一种免疫细胞化学染色方法及其在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤性病变的细胞学筛查技术领域，具体涉及一种免疫细胞化学染色方法及其在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤性病变的细胞学筛查及诊断可以早期发现部分恶性肿瘤，现在普及开展的宫颈液基细胞学检查有效降低了宫颈癌的发生率和病死率。然而，以巴氏染色为基础的液基细胞检查有其天然的缺陷:(1)、宫颈活检中尚有一部分病变要依赖P16及Ki67的检测才能区别出是高级别病变(HSILE)还是对炎症的应激性改变，这一部分病例在巴氏染色的细胞学中无能为力；(2)、取材不当，不合格，送检标本中病变细胞过少；(3)、部分病例基因水平已改变且已造成P16升高，细胞周期失控，但形态学尚未改变；(4)、医生未受严格长期培训，阅片量未达到最低要求，镜下有很多病变细胞而医生不敢确认，据信，有些病理医生一年几千例液基片，从未发过HSILE ;(5)、医生工作量过大，长时间疲劳阅片，导致漏诊率上升；(6)、制片技术未过关，人为改变细胞形态，病变细胞形态失真，无法辨认。
[0003]由于上述诸多原因，导致:大型三甲医院或顶级医疗中心，包括在病理医师训练严格的美国，假阴性率高达10%，基层医院比例更高。至于一年下来从未发过HSILE的医院，对于病人而言无异于灾难。参与宫颈癌筛查的人，如本已是HSILE或早癌，病理医师发一阴性报告，以后很长时间内，病人本身及给该病人诊疗的医生都会因这份假阴性报告而忽略早癌的相关症状(不体检反不会忽略)，在这一过程中，病理医师帮了倒忙。因此，发展一种客观的指标帮助病理医师从大量的细胞中轻易发现病变细胞具有巨大的社会和经济效益。
[0004]导致宫颈癌的主要原因是人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染，超过99%的宫颈癌都由高危型HPV引起，从正常宫颈发生病变继而进展到宫颈癌大概约需8-12年。宫颈癌癌前病变即宫颈上皮内瘤样病变(CIN)按严重程度可分为CINUCIN2和CIN3，不同阶段对应的治疗策略也不同。pl6INK4a是多瘤抑制因子I (MTS1)基因pl6的蛋白产物，逐渐受到广大临床医生的重视，它有助于辅助H&E判读，可显著提高CIN2、CIN3准确性和病理医师之间诊断的一致性。2012年，美国病理学会(CAP)和美国阴道镜与宫颈病理学会(ASCCP)的指南建议，使用特定克隆号(E6H4)的pl6INK4a抗体作为检测HPV感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物，该克隆号是全球唯一获得IVD认证的pl6INK4a抗体。在世界卫生组织2014年出版的《女性生殖器官肿瘤分类》(WHOClassificat1nofTumoursofFemaleReproductiveOrgans)第4版中，明确指出宫颈、外阴和阴道鳞状上皮病变的诊断采用LAST(LowerAnogenitalSquamousTermino1gyStandardizat1nofHPV-associatedNeoplasia,月工门及下生殖道HPV相关的鳞状上皮瘤变术语标准化)术语，应用二级分类命名法LSIlXLowgradesquamousintraepithelialles1n,低级别鱗状上皮内病变)和 HSIL(Highgradesquamousintra印ithelialles1n，高级别鳞状上皮内病变)，有利于诊断的一致性和可重复性，推荐使用pl6INK4a作为辅助LSIL和HSIL诊断的分子生物学指标。
[0005]由CAP和ASCCP的LAST项目研究，通过对6，063篇摘要、I, 210篇全文以及452组数据分析进行回顾，形成关于HPV组织病理学的命名推荐，参与讨论的涵盖病理和临床专业的44位委员与13位专家得出共识:采用二级命名法(LSIL和HSIL)更具可重复性，有利于病理医师和临床医师之间的交流。此外，加入pl6INK4a检测可帮助对CIN进行更准确的分级。建议对临床医生较难处理的CIN1-CIN2样本，pl6INK4a阳性时，可归为HSIL，判为CIN2 ；pl6INK4a阴性则可判为CINl，归为LSIL。
[0006]此外，LAST项目还证实，pl6INK4a的应用对提高诊断一致性具有高质量证据，推荐在以下四种情况中使用pl6INK4a =HSIL和类似非肿瘤性病变需要鉴别诊断时，如不成熟鳞化、萎缩、修复性上皮增生及人工操作所致假象；有疑问的CIN2 ;不同阅片人诊断意见不同；HPV检测、细胞学阴道镜提示有高级别病变可能，但组织学诊断为阴性。
[0007]大量研究数据还证实，CINl/pl6INK4a阳性进展为CIN2+的可能性远高于CINl/pl6INK4a阴性病变。因此，pl6INK4a有助于判断低级别宫颈病变患者预后，为临床医生随访和治疗提供有力依据。
[0008]pl6INK4a在病理活检上的应用价值甚大，如在细胞学筛查的基础上加染pl6INK4a和Ki_67 (细胞增殖指数)可以解决以上细胞学检查的诸多问题。然而，现有的文献现示，pl6INK4a和K1-67在组织学中对CIN病变具有高度特异性，在液基细胞学涂片中这种特异性却消失了，绝大部分研究发现涂片中的底层细胞、化生细胞和萎缩细胞都可阳性，当把液基细胞标本做成细胞蜡块切片以后，其特异性又回到组织学检查的水平。如果能在细胞涂片标本中就回复其特异性，就可以显著降低病理医生的工作量和误诊漏诊风险，也可以完全自动化和标准化，降低筛查成本，具有明显的经济和社会效益，为病人和临床医生带来福音。通过生物标志物pl6INK4a和Ki_67，不仅有助于病理科医生对CIN进行准确分级，并且可以帮助临床医生更全面的认识癌前病变和宫颈癌的特点，有助于对患者选择更合理的方式，有效管理宫颈癌前病变，才能真正降低宫颈癌发病率和死亡率。
【发明内容】
[0009]为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种免疫细胞化学染色方法，该方法步骤简单，操作控制方便，灵敏度高，特异性好。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种免疫细胞化学染色方法在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用，该应用可以为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
[0011]本发明的另一目的在于提供一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，该方法可以应用不同的标靶可对人体所有细胞学标本进行筛查检测，为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
[0012]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤:
A、当检测单个样本的单个目标物时: Al、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤Al制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取步骤A3制得的细胞涂片，用固定液进行固定，将细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
B、当检测多个样本的单个目标物时:
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤BI制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤B2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取步骤B3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
C、当检测单个样本的多个目标物时:
Cl、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤Cl制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取步骤C3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
D、当检测多个样本的多个目标物时:
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤Dl制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取步骤D3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
[0013]本发明的一种免疫细胞化学染色方法，该方法步骤简单，操作控制方便，灵敏度高，特异性好。
[0014]优选的，所述步骤A1、B1、C1和Dl中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成:醛类0.04%-2%、醇类10%-40%、酰胺类1%-20%、抗凝