一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药学领域中质量控制的运用方法，尤其涉及一种同时测定乌鸡增乳制 剂中17种氨基酸含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 乌鸡增乳制剂是益气养血，使气血生化促进乳汁分泌的良药，而氨基酸是补益药 效的有效成分。对于氨基酸的测定方法，现行质量标准为国家食品药品监督管理局标准 WS3-461(Z-054)-2005(Z)，其中蛋白质含量测定只是总氮测定方法，此方法只能说明产品 中氮元素含量，不能说明蛋白质，特别是氨基酸有效成分含量的多少。近年来，国内外对氨 基酸分析测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱（HPLC)法、离子色谱法、液质联用法、 氨基酸分析仪法等；分光光度法只能解决氨基酸总量的分析，无法确定氨基酸种类；HPLC 法与离子色谱法的前处理复杂且需要进行衍生化方可测定，专一性不强；液质联用法仪器 昂贵，前处理要求高，操作难度大。全自动氨基酸分析仪采用离子交换柱将对其吸附程度不 同的氨基酸分离，分离后的氨基酸再进入仪器的柱后衍生反应检测单元与反应液在反应柱 上发生显色反应，从而被检测出来；全自动氨基酸分析仪法不需要氨基酸衍生化步骤，前处 理简单，并且具有专一性强、重复性好、精确度高等优点，逐渐成为氨基酸分析测定的主要 方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的首要目的是提供一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法，本发明中 的氨基酸测定方法具有操作简便、精密度高、重复性好、回收率好等优点。
[0004] 为实现本发明目的，本发明提供一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法，包 括对乌鸡增乳制剂进行蛋白质水解处理；然后采用氨基酸分析仪对水解产物进行氨基酸含 量测定。
[0005] 其中，所述水解处理是将乌鸡增乳制剂中的蛋白质水解成游离氨基酸。
[0006] 特别是，所述蛋白质水解处理是将乌鸡增乳制剂与盐酸溶液混合后置于水解瓶 中，在氮气保护下，于温度>KKTC的条件下进行所述的蛋白质水解处理。
[0007] 尤其是，精密称取约55±2mg乌鸡增乳制剂与5-6mol/L盐酸溶液10ml，后置于水 解瓶中，在氮气保护下，于温度100-1KTC的条件下进行所述的蛋白质水解处理。
[0008] 特别是，所述盐酸溶液的浓度为6mol/L;所述蛋白质水解处理的温度优选为 IKTC;处理时间为20-24h，优选为22-24h，进一步优选为22h。
[0009]特别是，还包括将蛋白质水解处理的反应混合物干燥后溶于浓度为 0. 01-0. 02mol/L盐酸溶液后，再采用氨基酸分析仪进行所述的氨基酸含量测定。
[0010] 尤其是，还包括将蛋白质水解处理的反应混合物干燥后溶于浓度为〇. 〇2mol/L盐 酸溶液后，再采用氨基酸分析仪进行所述的氨基酸含量测定。
[0011] 尤其是，精密称取约55±2mg乌鸡增乳制剂置于水解管中，加5-6mol/L盐酸溶 液10ml，充氮气封口，将已封口的水解管置于100-1KTC的恒温干燥箱内，水解22-24h后， 取出冷却；打开水解管，将水解液全部转移至蒸发皿中，置于水浴上蒸干，向残渣中加适量 0? 01-0. 02mol/L盐酸溶液溶解并转移至50ml量瓶中，加0? 01-0. 02mol/L盐酸溶液稀释至 刻度，定容，摇匀，用微孔滤膜滤过，取滤液作为待测品溶液，再采用氨基酸分析仪进行所述 的氨基酸含量测定。
[0012] 本发明采用氨基酸分析仪对水解产物进行氨基酸含量测定，其中，所述氨基酸含 量测定过程中的色谱条件为：
[0013] 色谱柱的填料为离子交换树脂；反应柱的填料为金刚砂惰性材料；
[0014] 蛋白质水解分析缓冲溶液包括：PH-I;PH-2 ;PH-3 ;PH-4 ;PH-RG;反应液包括：茚 三酮；讳三酮缓冲液；5%乙醇；所述蛋白质水解分析缓冲溶液按照下表配制而成 ：
[0017] 所述反应液按照下表配制而成：
[0019] 检测波长：570nm、440nm;色谱柱柱温：57°C;反应柱柱温：135°C;进样量：20ill; 所述蛋白质缓冲溶液的流速为0. 400ml/min;反应液的流速为0. 350ml/min。
[0020] 特别是，在570nm波长下检测门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、 胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸； 在440nm波长下检测脯氨酸。
[0021] 其中所述氨基酸含量测定过程中色谱柱的流动相按照下表的梯度进行洗脱：
[0022]
[0023] 所述反应柱的流动相按照下表的梯度进行洗脱：
[0026]特别是，在进行乌鸡增乳制剂蛋白质水解处理之前，还包括绘制氨基酸标准曲线， 即首先分别精确称取适量的17种氨基酸标准品：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨 酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨 酸、组氨酸、精氨酸，接着将17中氨基酸标准品一并溶于盐酸溶液，配制成氨基酸混合标准 品溶液，然后采用氨基酸分析仪测定氨基酸标准品溶液中氨基酸的含量；然后分别以各氨 基酸的浓度为横坐标，相应氨基酸的峰面积为纵坐标绘制17种氨基酸标准品的标准曲线， 分别获得17种氨基酸标准品的线性方程。
[0027]特别是，所述17种氨基酸标准品的质量分别为：门冬氨酸69±2mg、苏氨酸 30 ± 2mg、丝氨酸28 ± 2mg、谷氨酸83 ± 2mg、脯氨酸90 ± 2mg、甘氨酸65 ± 2mg、丙氨酸 4±2mg、胱氨酸35±2mg、纟颜氨酸10±2mg、甲硫氨酸25±2mg、异亮氨酸53±2mg、亮氨酸 15±2mg、酿氨酸29±2mg、苯丙氨酸36±2mg、赖氨酸14±2mg、组氨酸40±2mg、精氨酸 67±2mg;所述盐酸溶液的浓度为0? 01-0. 02mol/L，优选为0? 02mol/L。
[0028]尤其是，分别精密量取氨基酸混合标准品溶液2. 5ml、4. 0ml、5. 0ml、6. 0ml、7. 5ml置于不同的50ml量瓶中，加0. 02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，定容，摇匀，制得氨基酸分析 仪的测定液，然后进行标准曲线的绘制。
[0029]氨基酸分析仪作为一种氨基酸分析的经典专用仪器，其原理是利用各氨基酸在阳 离子交换树脂色谱柱上的吸附程度不同，按照设定的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓 冲溶液依次将氨基酸洗脱下来；分离后的氨基酸再进入仪器的柱后衍生反应检测单元与反 应液在反应柱上发生显色反应，生产蓝紫色物质可在570nm被检测到（仲氨生成浅黄色物 质在440nm检测）。
[0030]根据测定的氨基酸标准品的标准曲线，以外标法计算乌鸡增乳制剂中氨基酸含 量。
[0031]本发明所具有的有益技术效果，至少包含：
[0032] 1、本发明所述的氨基酸含量的测定方法首次将全自动氨基酸分析仪应用于乌鸡 增乳制剂中同时测定17种氨基酸的含量。
[0033]2、对于乌鸡增乳制剂中氨基酸含量测定方法，现行的质量标准为国家食品药品监 督管理局标准WS3-461 (Z-054)-2005 (Z)，2005年颁发至今已有8年历史，其中蛋白质含量 测定只是总氮测定方法，此方法只能说明产品中氮元素的含量，不能说明蛋白质，也别是氨 基酸等有效成分含量的多少，单纯控制氮元素的含量并不能保证产品安全有效。
[0034]3、本发明提供的氨基酸含量的测定方法解决了乌鸡增乳制剂中氨基酸含量测定 的难题，能精确测定出每一种氨基酸的含量，能较好地反映乌鸡增乳制剂中蛋白质及氨基 酸的情况，为更好的控制乌鸡增乳制剂的内在质量提供了一种可靠、有效的方法。
[0035]4、本发明提供的氨基酸含量的测定方法不需要氨基酸衍生化，节省试验时间，简 化试验步骤，本方法对操作人员的操作熟练程度要求较低，很容易普及推广。
[0036] 5、本发明提供的氨基酸含量的测定方法具有专一性强、重复性好、精确度高、回收 率好等优点，能很好的提高乌鸡增乳制剂内在质量的可控性和安全有效性。
【附图说明】
[0037] 图1为氨基酸混合标准品色谱图；
[0038] 图2为待测品溶液色谱图
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
[0040] 仪器与试药
[0041] 仪器：L-8900日立全自动氨基酸分析仪；DN-44干燥箱；水浴锅；色谱柱：以阳离 子交换树脂为填料的日立公司#2622PH色谱柱（4.6mmX60mm，3iim);反应柱：以金刚砂惰 性材料为填料的日立#2650L反应柱（4. 6mmX40mm)。
[0042]试药：乌鸡增乳胶囊样品 16 批（批号：1205003、1206004、1207005、1208006、 1210007、1211009、1301001、1301002、1301003、1302004、1303005、1303006、1303007、 1307008、1309009、1309010)，乌鸡增乳大颗粒（批号2014006-007)，乌鸡浓缩液（批号 20140201)，乌鸡骨粉（批号20140202)均由天津亚宝药业科技有限公司提供；氨基酸标准 品（批号020080154)由中国食品药品检定研究院提供，除谷氨酸纯度为99. 5%，甲硫氨酸 纯度为99. 7%外，其余均按100%计算；蛋白质水解缓冲溶液及反应液（茚三酮、茚三酮缓 冲液、5%乙醇）均购自日立公司，其组分见表1-2,所述蛋白质水解缓冲溶液及反应液按照 L-8900日立全自动氨基酸分析仪使用说明书配制；盐酸为分析纯。
[0043] 表1蛋白质水解分析缓冲液的组分
[0044]
[0045] 备注：*将25g溶于IOOmL蒸馏水
[0046] 表2反应液组分
[0049] 实施例1氨基酸混合标准品溶液的制备
[0050] 各取17种氨基酸标准品适量，精密称定，置同一 250ml量瓶中，加0. 02mol/