Psmd4蛋白的elisa检测试剂盒及其检测方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂 盒及其检测方法与在肝癌血清学诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国最常见恶性肿瘤之 一，每年新发病例约占全球50 %。由于肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。 因此，肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。
[0003] 目前肝癌的诊断主要依靠实验室检查、影像学检查以及肝穿刺组织学检查。影 像学诊断在肝癌诊断中起重要作用，但在诊断小于2公分的小肝癌及区分良恶性结节方 面具有一定的局限性。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的金标准，但细针穿刺因取材 有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的风险。临床上，血清甲胎蛋白 (a-fetoprotein，AFP)是目前唯一广泛应用的HCC标志物。但是近年研究报道，以AFP诊断 HCC的阳性率仅为60% -70%，在小肝癌中敏感性更低，容易造成漏诊；其次在一些良性肝 病、生殖性畸胎瘤等患者中也可有升高，容易造成误诊。因此，临床仍需要高度敏感的血清 肝癌特异标志物来鉴别肝脏良恶性病变，或在高危人群进行随访提高肝癌的早期诊断率。
[0004]HCC血清标志物的研究一直是科学家们研究的重点，但大多数研究成果难以满足 实际应用的需要。探索高敏感性及特异性的血清学指标尤为重要。
[0005] 本发明中的研究对象一PSMD4蛋白，是一个蛋白酶体26S非ATP酶亚基 4(GeneID:5710)。该分子含有两段15个氨基酸的泛素相互作用模序（ubiquitin interactingmotif,UIM)，能够选择性结合泛素化蛋白，介导蛋白质降解。已有研究报 道，PSMD4异常表达与炎症性肠病、溃疡性结肠炎等疾病相关，PSMD4在肝癌中的表达及 生物学功能尚不十分清楚。有研究显示，PSMD4可能与细胞分化和机体发育有关（参 见文南犬：Smalle,J,etal.Thepleiotropicroleofthe26Sproteasomesubunit RPN10inArabidopsisgrowthanddevelopmentsupportsasubstrate-specific functioninabscisicacidsignaling.PlantCell,2003. 15 (4) :p. 965-80.； Szlanka，T，etal.DeletionofproteasomalsubunitS5a/Rpnl0/p54causes lethality,multiplemitoticdefectsandoverexpressionofproteasomalgenesin Drosophilamelanogaster.JCellSci，2003. 116(Pt6) :p. 1023-33. ;Hamazaki，J.，et al.,Rpnl〇-mediateddegradationofubiquitinatedproteinsisessentialformouse development.MolCellBiol，2007.27(19):p.6629-38)。我们发现PSMD4 是一个重要的肝 癌癌蛋白，并且可以释放入血。本申请人已就PSMD4作为肝癌预后诊断标志物的新用途申 请了中国专利CN201310005491. 4,发明名称为"PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中 的应用"，公开号为CN103091493A。
[0006] 目前尚无文献报道在肝癌血清样品中准确检测到PSMD4蛋白；也尚无针对肝癌血 清样品中的PSMD4蛋白含量提供一种准确、简便、灵敏度高的检测手段；也尚无文献报道 PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒以及该类试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒；本发明的另一目的是 提供利用上述试剂盒的检测方法；本发明的第三目的是提供上述试剂盒在肝癌血清学诊断 中的应用。
[0008] 本发明旨在为临床和实验室肝癌血清样品中PSMD4蛋白含量提供准确、简便、灵 敏度高、并可被广泛使用的检测手段。
[0009] 本发明人经过广泛而深入的研究，采用酶联免疫吸附法检测PSMD4蛋白在肝癌病 人血清中的表达水平，并首次证实在肝癌病人的血清中存在PSMD4蛋白。
[0010] 本发明第一方面，提供了一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所述的ELISA检测 试剂盒包括：
[0011] (1)包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板，所述的包被抗体为兔抗人PSMD4的多克 隆抗体；较优的，兔抗人PSMD4的多克隆抗体购自PTG公司；最优的，抗体工作浓度为2yg/ ml〇
[0012] (2)检测PSMD4抗原的抗体，为小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体；较优的，小鼠抗人 PSMD4的单克隆抗体购自PTG公司；最优的，检测抗体的工作浓度为0. 5yg/ml。
[0013] (3)酶标二抗，HRP(辣根过氧化物酶）标记的山羊抗小鼠IgG;较优的，HRP标记 的山羊抗小鼠IgG购自PTG公司；最佳的，稀释浓度为1:5000。
[0014] (4)标准蛋白，为重组人PSMD4融合蛋白；较优的，重组人PSMD4融合蛋白购自PTG 公司。
[0015] (5)所述的试剂盒，还包括有：常规的样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶 标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液；
[0016] 所述的试剂盒，ELISA酶标板为市售的ELISA酶标板，优选德国greiner公司的 ELISA酶标板（96孔单条可拆酶标板#650180);
[0017] 包被缓冲液，选用IXPBS，pH: 7. 4;
[0018] 封闭液，选用含3 %牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；
[0019]ELISA酶标板洗涤液，较优的为含0? 05%Tween-20的1XPBS溶液；
[0020] 样品稀释液：样品为血清时，较优的为1XPBS，pH: 7. 4;
[0021] 抗体稀释液，选用1XPBS;
[0022] 显色液，选用sigam公司的3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺（TMB);
[0023] 终止液，较优的为2mol/L的硫酸溶液。
[0024] 本发明所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所用的试剂、条件进一步优 化：
[0025](1)包被抗体的优化：本发明的试剂盒，分别选用不同的抗体包被：兔抗人PSMD4 的多克隆抗体（Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、兔抗人PSMD4的多克隆抗体（PTG公司， #14899-1-AP)，鼠抗人PSMD4 的单克隆抗体（Abnova公司，#H00005710-APll-2)、鼠抗人 PSMD4 的单克隆抗体（PTG公司，#66179-1-Ig)，检测浓度选用 7. 5yg/ml，5yg/ml，2. 0yg/ ml，1yg/ml，0. 5yg/ml，0. 25yg/ml。结果发现选用兔抗人PSMD4的多克隆抗体（Abnova公 司，#H00005710-AP11-1)、鼠抗人PSMD4 的单克隆抗体（Abnova公司，#H00005710-APll-2 ;PTG公司，#66179-1-Ig)作为包被抗体均存在明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度 数值没有相关性；但是使用兔抗人PSMD4的多克隆抗体（PTG公司，#14899-1-AP)则没有明 显的非特异性反应，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。经过反复优化，抗体工作浓 度2yg/ml为最佳，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。
[0026] (2)检测抗体的优化：本发明的试剂盒，分别选用不同的抗体作为检测抗体：当 包被抗体为兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体（Abnova公司；#H00005710-AP11-1 ;PTG公司， #14899-1-AP)时选用鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体（Abnova公司，#H00005710-APll-2 ; PTG公司，#66179-1-Ig)分别作为检测抗体；当包被抗体为鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体 (Abnova公司，#H00005710-APll-2;PTG公司，#66179-1-Ig)时选用兔抗人PSMD4 的两种多 克隆抗体（Abnova;#H00005710-AP11-1;PTG公司，#14899-1-AP)。检测浓度选用 2. 0yg/ ml，1yg/ml，0. 5yg/ml，0. 25yg/ml，0. 1yg/ml。结果发现包被抗体兔抗人PSMD4 的多克 隆抗体（Abnova公司；#H00005710-AP11-1)与鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体（Abnova公 司，#H00005710-APll-2 ;PTG公司，#66179-1-Ig)配伍时呈现明显的非特异反应，标准品的 浓度和吸光度数值没有相关性；兔抗人PSMD4的多克隆抗体（PTG公司，#14899-1-AP)与鼠 抗人PSMD4的单克隆抗体（Abnova公司，#H00005710-APll-2)配伍时同样存在明显非特异 反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；分别将两种包被抗体鼠抗人PSMD4的单克 隆抗体（Abnova公司，#H00005710-APll-2;PTG公司，#66179-1-Ig)与兔抗人PSMD4 的两 种多克隆抗体（Abnova;#H00005710-AP11-1 ;PTG公司，#14899-1-AP)配伍，结果也存在明 显非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性。通过多次排列组合验证发现，仅在 选用