量推算转录因子的含量。
[0026] 以下详述利用血糖仪检测汞离子的具体步骤： 1)介孔娃纳米颗粒制备和表面氨基修饰 a) MSN的制备： 首先，1.75 mL 的 NaOH (2.00 M)加入到 240 mL 的 CTABr (2 mg. mL_1)加热至 95 ° C。随着持续的搅拌，2.5 mL的TE0S逐滴加入。整个混合物持续搅拌3个小时来得到白 色沉淀物，分离固体，用去离子水和乙醇冲洗后，60 ° C干燥过夜。最终在550° C下煅烧 5个小时得到介孔娃纳米颗粒。
[0027] b) MSN表面修饰氨基基团： 首先，对MSN表面进行氨基化修饰。在圆底烧瓶加入0.5 g的制备好的MS，0.5 mL的 APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷）和50 mL的无水乙醇。混合物在36 ° C下持续搅拌6小 时，滤过并用乙醇清洗，最后在60 ° C下干燥得到氨基修饰的介孔硅纳米颗粒。
[0028] 2)核酸序列设计和合成 针对基于T-T错配检测汞离子的血糖仪策略，设计的序列如下：
3)修饰后介孔硅颗粒孵育与包埋 取5mg的氨基修饰的介孔硅纳米颗粒分散在500 y 1溶有2M葡萄糖的杂交缓冲液 (pH 7. 4,包括 10 mM Tris-HCl, 50 mMNaCl,和 10 mM MgCl2)，孵化过夜。用 200 y M 的 DNAl(20iiL)作为纳米塞封闭介孔硅颗粒上的孔洞，在4°C下温和震荡反应8 h。然后通过 离心（5000g，5min)，反复用缓冲液冲洗，得到纯化的介孔硅颗粒，用200 y L缓冲液重悬。
[0029] 4)检测信号的放大及检测 首先，取10 yL制备好的核酸封闭介孔硅溶液于200 yL PCR管，加入不同浓度标准化 汞离子与m2-dna(200nM)的混合液，常温孵化20分钟，接着加入20U的EXOIII 37°C震荡反 应40 min，从而放大信号，提高灵敏度。取出4yL用于血糖仪检测。通过多组数值测量，构 建出靶标物质浓度与葡萄糖浓度的关系曲线（如图2)，通过检测葡萄糖的浓度反应靶标物 质浓度，从而实现血糖仪对汞离子的检测。
[0030] 实施例2 :利用本发明所述方法对不同浓度的汞离子的检测 配制汞离子标准溶液，浓度分别为： InM，0? 3nM, 0? 5nM, 0? 7nM, 0? 9nM, 10nM, 20nM, 40nM, 80nM，室温保存。
[0031] 将不同浓度的汞离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应，最 后取4 mL上清用血糖仪来检测，25秒后记录血糖仪读数。
[0032] 从图2的检测结果可以看出，当0.1 nM的汞离子存在时，可在血糖仪上读取到对应 的读数，说明血糖仪生物传感器对汞离子的检测限为〇. InM，比传统的EPA要求的饮用水汞 离子灵敏度高100倍。并且，随着汞离子浓度的增加（〇. InM到80nM)，血糖仪读数也随着增 加，汞离子浓度与血糖仪读数呈很好的线性关系，其线性范围是从〇. InM到10nM。
[0033] 实施例3 :利用本发明所述方法对不同物质的检测 配制5.0yM其他不同重金属离子的标准溶液，它们分别是Pb2+，Mn2+，Zn 2+，Ni2+， Cu2+，Fe2+，Fe3+，Cd2+和 Co2+。
[0034] 将5. 0 y M不同物质标准溶液和lOnM标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体 系中，充分反应，最后取4 mL上清用血糖仪来检测，25后秒记录血糖仪读数。
[0035] 从图3的检测结果可以看出，其他金属离子对检测没有影响，只有当加入汞离子 后才会在血糖仪上出现读数。这证明本发明所述方法对汞离子的检测具有很好的特异性。
【主权项】
1. 一种利用介孔硅可控释放体系与血糖仪检测汞离子的方法，其特征在于：包括以下 步骤： (1) 介孔硅纳米颗粒(MSN)制备和表面氨基修饰，将修饰后介孔硅纳米颗粒与葡萄糖溶 液孵化后，用单链核酸将介孔硅的孔洞封闭； (2) 在汞离子存在下，加入辅助单链核酸，与所述单链核酸T-T错配形成双链核酸，所 述双链核酸一端为平末端，另一端为3'凸出末端，介孔硅上吸附的单链核酸从而脱落，介孔 硅的孔洞打开，葡萄糖得到释放； (3) 检测信号的放大，加入核酸外切酶III，酶反应从所述双链核酸平端的3' -5'的方向 降解所述单链核酸，辅助单链核酸游离，继续与介孔硅上吸附的单链核酸杂交，形成循环； (4) 取反应液离心后的上清液，用常规的血糖仪来检测葡萄糖含量，通过制备标准曲 线，读取样品中汞离子的含量。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3)所述检测信号的放大，加入 酶是核酸外切酶III或Nicking核酸内切酶中的一种。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1)中所述单链核酸序列至少含 有一个TT序列，所述单链核苷酸序列上设有核酸外切酶III或Nicking核酸内切酶的酶切位 点，Nicking核酸内切酶的酶切位点在形成的双链核酸的末端。4. 如权利要求要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（2)中的辅助核酸为将与 所述单链核酸序列TT互补的AA用TT替换的所述单链互补序列。5. 如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于：所述单链核苷酸序列TT序列为至 少两个连续T构成。6. 如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于：所述单链核苷酸序列含有一个TT 序列。
【专利摘要】本发明涉及一种利用介孔硅可控释放体系与血糖仪检测汞离子的方法，包括以下步骤：（1）介孔硅纳米颗粒（MSN）制备和表面氨基修饰，将修饰后介孔硅纳米颗粒与葡萄糖溶液孵化后，用单链核酸将介孔硅的孔洞封闭；（2）在汞离子存在下，加入辅助核酸，与所述单链核酸T-T错配形成双链核酸，所述双链核酸一端为平末端，另一端为3’凸末端，介孔硅上吸附的单链核酸从而脱落，介孔硅的孔洞打开，葡萄糖得到释放；（3）检测信号的放大；（4）使用血糖仪读取样品中汞离子的含量。本发明所述的检测方法具有很高的灵敏度与特异性，而且操作简单、成本低廉、检测快速，检测仪器可便携，适合对普通大众进行推广。
【IPC分类】G01N33/00
【公开号】CN105203715
【申请号】CN201510657617
【发明人】曾令文, 梁晓玲, 王琳
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月14日