一种荧光生物传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于荧光传感器制备技术领域，具体涉及一种荧光生物传感器的制备方法 及其应用，是一种基于无标记的携带聚胸腺嘧啶的单链DNA为模板的铜纳米粒子与目标调 节的光诱导电子转移体系构建的荧光生物传感器，在检测HBV基因的应用。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)是一种DNA病毒，可通过血液、精液和其他体液进行传播，是 全球最常见的传染性很强传染病之一，可能会导致慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。乙型肝 炎病毒（HBV)属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae)，基因组长约3. 2kb，为部分双链环状 DNA〇
[0003] 全世界大约有二十亿人已经感染此病毒，大约有3. 5亿人处于感染阶段，各国均 面临由HBV病毒感染引发的挑战和威胁，早期诊断HBV基因带来的致命性突变显得尤为紧 迫。
[0004] 目前对于HBV基因在实际样品中的检测多涉及复杂和耗时冗长的检测过程，或是 涉及到外部荧光信号分子的标记，因此开发高选择性、高灵敏性、简单无标记的荧光生物传 感器检测HBV基因至关重要。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种荧光生物传感器的制备方法，基于无标 记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光与目标调节的光诱导电子转移构 建的荧光生物传感器，利用无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA模板，产生铜纳米粒子发光 体，构建由HBV基因调节的光诱导电子转移的荧光传感器。
[0006] 本发明还提供了一种荧光生物传感器的应用，利用制备的荧光生物传感器，不同 浓度的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对HBV基因灵敏性、特异性的检测。
[0007] 本发明提供的一种荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)、将ssDNA溶液加入缓冲溶液中、然后加入HBV基因溶液，一段时间后，加入 hemin (血晶素）溶液和KC1溶液，培养，得到混合溶液；
[0009](2)、在步骤（1)制备的混合溶液中，加入CUS(V§液和抗坏血酸钠溶液，培养10 分钟，利用ssDNA上的探针和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的 G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得 到 "关闭"的荧光生物传感器。
[0010] 步骤⑴中体积比ssDNA溶液：缓冲溶液：HBV基因溶液：hemin溶液：KC1溶液= 2:160:2:1:10。
[0011] 进一步的，步骤⑴具体为：将2 y L的ssDNA溶液加入160 y L的10mM MOPS (3- (N-吗啉基）丙磺酸）PH = 7. 6的缓冲溶液中，然后加入2 y L HBV基因溶液，5min 后，加入1 y L的hemin溶液和10 y L的KC1溶液，培养，得到混合溶液；
[0012] 进一步的，所述培养的条件为37 °C培养2h。
[0013] 进一步的，所述ssDNA溶液制备方法为：将ssDNA序列溶解在10mM MOPS PH = 7. 6 的缓冲溶液中，ssDNA基因序列的浓度为500nM。
[0014] 进一步的，所述ssDNA序列为携带聚胸腺嘧啶的单链DNA序列：GGGTTGGG-polyT 3 。-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACTGGGTAGGG，其中含有 polyT30、被拆分成两部分的 G4 序列和 探针序列：TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT ;所述polyT30是由30个T碱基构成的DNA序列。
[0015] 进一步的，步骤（1)中所述hemin溶液浓度为1. 0 y M溶液；所述KC1溶液浓度为 50mM〇
[0016] 进一步的，步骤（2)具体为：在步骤（1)制备的混合溶液中，加入10 y L的(：11304溶 液和240 y L抗坏血酸钠溶液，培养，利用ssDNA上的探针部分会和HBV基因碱基互补配对， 阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产 生光诱导电子转移作用的原理，制备得到"关闭"的荧光生物传感器。
[0017] 进一步的，步骤（2)中所述培养，为20°C培养5min。
[0018] 进一步的，步骤（2)中所述CuS04溶液浓度为10mM、所述抗坏血酸钠溶液浓度为 100mM 〇
[0019] 本发明提供的一种荧光生物传感器的应用，检测HBV基因的应用。
[0020] 进一步的，检测HBV基因的应用，具体为：利用制备的荧光生物传感器，不同浓度 的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对荧光生物传感器灵敏性、特异性的检 测 。
[0021] 本发明提供的无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光与目 标调节的光诱导电子转移构建的荧光生物传感器，可应用于HBV基因的检测。本发明使用 携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光作用，利用G-四连体和铜纳米粒子之间 产生光诱导电子转移使铜纳米粒子的发光产生猝灭的现象，制备出基于携带胸腺嘧啶DNA 为模板的铜纳米粒子与光诱导电子转移体系构建荧光传感器，利用目标（HBV基因）和探针 结合形成结构紧凑的体系拉远G-四连体和铜纳米粒子之间距离的原理，实现了对HBV基因 灵敏性、特异性的检测。
[0022] 与现有技术相比，本发明提供的荧光传感器的制备方法，使用的是无标记的DNA， 操作简单，成本很低，避免任何化学标记和修饰。通过G-四连体和铜纳米粒子之间的光诱 导电子转移作用，能够制备出检测HBV基因的传感器。结果显示此传感器对HBV基因1到 500mM有灵敏的检测，且具有操作简单，灵敏度高，检测限低。
【附图说明】
[0023] 图1A为实施例1制备的发荧光的Cu NPs和G-四连体荧光猝灭示意图；
[0024] 图1B为ssDNA/铜纳米粒子和G-四连体在目标调节下光诱导电子转移检测HBV 基因的不意图；
[0025] 图2A为ssDNA/铜纳米粒子的紫外吸收可见图；
[0026] 图2B为ssDNA/铜纳米粒子的荧光发射光谱；
[0027] 图2C为荧光发射光谱对应时间关系；
[0028] 图2D为ssDNA/铜纳米粒子的透射电镜；
[0029] 图2E为ssDNA/铜纳米粒子的透射电镜结果的统计；
[0030] 图3A为PolyT30/铜纳米粒子（a)在加入hemin(b)和加入G4(c)及共同加入这 两种物质（d)的猝灭现象；
[0031] 图3B根据图3A构建的柱状图；
[0032] 图4A为血晶素的紫外可见吸收光谱；
[0033] 图4B为在血晶素存在的情况下，polyT30/铜纳米粒子和富鸟嘌呤序列的DNA的 可见吸收光谱；
[0034] 图4C polyT30/铜纳米粒子/玻碳电极在磷酸缓冲溶液（PBS)里的循环伏安（CV) 图；
[0035] 图4D生成后的辣根过氧化物酶/玻碳电极在磷酸缓冲溶液（PBS)里的循环伏安 (CV)图；
[0036] 图4E为polyT30/铜纳米粒子在没有（a)和有富鸟嘌呤序列的DNA和血晶素（b) 存在时的荧光寿命；
[0037] 图5A为在形成G-四连体以后ssDNA/铜纳米粒子的荧光猝灭了（b)，在形成G-四 连体之前加入HBV基因荧光没有猝灭（a)，若在形成G-四连体之后加入HBV基因（d)的荧 光强度。
[0038] 图5B为电化学研究，关于：ssDNA/铜纳米粒子没有加入HBV基因后，加入G4和 hemin形成了形成具有辣根过氧化酶的催化过氧化氢性质（b)和加入HBV基因阻碍G-四连 体的形成因而无催化过氧化氢的性质（a);
[0039] 图6A为不同浓度HBV基因对应荧光光谱；
[0040] 图6B为不同浓度HBV基因对应荧光强度；
[0041] 图6C为荧光强度与不同HBV基因浓度线性关系；
[0042] 图6D为选择性的检测（在完全互补配对和1错配2错配3错配及全部错配的荧 光强度）；
[0043] 图6E为在实样中的检测（在人血清中加入标液和体外加标液的五组浓度对比）。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 验证G-四连体可以猝灭CuNPs:
[0046] a、取1 y L的polyT30溶液加入到80 y L的10mM MOPS (3- (N-吗啉基）丙磺酸） PH = 7. 6的缓冲溶液中，再加入5 y L的CuS04溶液（10mM)和120 y L抗坏血酸钠的溶液 (100mM)，得到混合溶液1，得到发荧光的Cu NPs，检测荧光强度；
[0047] 所述polyT30溶液的制备方法为：将polyT30溶解到10mM MOPS (3- (N-吗啉基） 丙磺酸）PH = 7. 6的缓冲溶