5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的用图
【专利说明】5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的用途
[0001]本发明涉及5-氟胞嘧啶的新用途，尤其涉及5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途，属于5-氟胞嘧啶的应用领域。
[0002]
技术领域
[0003]蛋白质组学(proteomics)是指以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，从细胞水平及整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识有机体的各种生理和病理。与传统蛋白质研究比较，蛋白质组学研究体现了全面性、整体性、高通量、大规模的特点。蛋白质组学的研究对于已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析具有无法替代的重要作用。蛋白质组学技术较为复杂，包括蛋白质分离、鉴定和信息分析三方面的内容。其中，凝胶电泳是与分离和鉴定相对应的核心技术之一。
[0004]自1959年Raymond和Weintraub首次使用聚丙烯酰胺作为电泳的支持介质，特别是20世纪60年代初Hjerten、Ornstein和Davis发表不连续电泳系统的基础工作以来，聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验最常用的支持介质，通过使用强阴离子SDS建立的SDS-PAGE技术已成为蛋白质分离、分析的常用方法。为了确定多肽链的分子量，就必须在有阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠的存在下进行蛋白电泳。这种去污剂不仅可以完全打开蛋白质的折叠结构，而且可以和未折叠的肽链结合产生恒定的电荷密度。这意味着可以只依据蛋白质分子量对蛋白质进行分离。并通过与已知分子量的蛋白标准品进行比对而得知未知蛋白的分子量。而在蛋白质组学试验中，蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的染色是一个十分重要的环节。常用的蛋白质染色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色等。其中，考马斯亮蓝(CBBR和CBBG)染色是最常用的蛋白质染色方法，它具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点。但是此方法通常涉及到几个小时的蛋白质固定，染色和脱色过程。并且染色和脱色试剂都具有腐蚀性和刺激性气味，考马斯亮蓝的蓝色染色沾染在操作仪器等物品上也很难消除，除此之外，经过染色剂染色的聚丙烯酰胺凝胶也无法再进行下游相关的蛋白质检测操作。银染是目前公认的除了放射性标记以外最为灵敏的蛋白质检测方法，可以在纳克级水平上检测蛋白。但是，银染通常会有相对低的重复性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛会对蛋白质进行修饰，导致银染的后续蛋白质组学研究的兼容性能普遍不佳。最近发展以来的荧光染色技术有很高的灵敏度和后续蛋白质组学研究兼容性。但由于荧光染料价格昂贵，且极易淬灭，还需要高端的仪器设备和特殊的分析软件，限制了该项技术在蛋白质组学领域的广泛应用。
[0005]Westernblot凝胶电泳是后续的蛋白质组学研究技术之一,其主要是用来识别、量化、并确定特定蛋白的大小。Western blot是由Northern blot和Southern blot演化而来。在20世纪70年代后期，Towbin等人(1979年)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。Bumette等人(1981年)使用应用广泛的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，这最终将这种方法被称为Western印迹。它也被称为蛋白质印迹或免疫印迹，并迅速成为蛋白质组学研究的有力工具。Western blot的方法是先用凝胶电泳分离天然或变性的蛋白质，然后将蛋白质转移到膜上，用未标记的特异性一抗与转移到膜上的抗原结合，再加入标记(酶、荧光、生物素等标记)的二抗进行免疫检测，存在检测步骤多、成本高等缺陷，有待改进。
【发明内容】
[0006]本发明目的之一是提供5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途；
[0007]本发明目的之二是将用5-氟胞嘧啶染色蛋白质的方法进行了优化；
[0008]本发明目的之三是提供了一种改进的蛋白质检测方法；
[0009]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0010]针对现有的蛋白质染色剂或染色方法所存在的各种缺陷，本发明人进行了深入研究，最终发现，5-氟胞嘧啶可以作为蛋白质的染色剂。用5-氟胞嘧啶作为蛋白质的染色剂，染色步骤简便、染色所需时间短，所需染料的量少及5分钟内可完成检测，染色后的蛋白产物经紫外激发后可以肉眼直观检测也可以被仪器检测，从而完成了本发明。
[0011]本发明首先提供了 5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途；5_氟胞嘧啶可以在蛋白质的标记或检测等领域中有了多种用途，诸如:将标准量的蛋白质用5-氟胞嘧啶染色后制作预染蛋白质分子量标准品(marker)以及质谱分析前端的目的蛋白筛选和鉴定等。
[0012]进一步，本发明提供了用5-氟胞嘧啶对蛋白质进行染色的方法，该方法包括:在聚丙烯酰胺凝胶混合液(聚丙烯酰胺凝胶混合液的组成成分为Tris-Cl、丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、SDS、过硫酸铵、TEMED0 )聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液或将5-氟胞嘧啶溶液提前混入聚丙烯酰胺凝胶组分之一的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液中4°C贮存，，制备凝胶时取出直接作为组分使用则凝胶聚合前不再需要添加5-氟胞嘧啶或将5-氟胞嘧啶溶液与需要染色的蛋白质混合进行反应或将聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后放入该5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色。
[0013]其中，在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液的体积比范围为0.1%至5% ;5_氟胞嘧啶溶液与聚丙烯酰胺凝胶组分(丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液)的混合比例优选为1: 500至1: 50 ;5_氟胞嘧啶溶液与蛋白质的体积比优选为1: 20至1: 5。
[0014]适用于5-氟胞嘧啶染色的蛋白质可以是任何一种需要采用染色的方法进行定性或定量检测的蛋白质，例如:在蛋白检测中作为蛋白质分子量标准品(marker)的蛋白质。
[0015]由此，本发明提供了一种预染色的蛋白质分子量标准品，通过将标准量的蛋白质用5-氟胞嘧啶染色后制备得到。
[0016]本发明提供了一种优化的检测蛋白质的Western blot方法，该方法包括:用凝胶电泳分离待检测的蛋白质；将凝胶电泳分离的蛋白质转移到膜上；通过紫外光检测系统直接检测转膜效率及蛋白质在膜上的分布，以确定是否完成后续实验，节省检测时间，降低检测成本。
[0017]综上，采用5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂具有价格低廉，操作简单，染色所需时间短，灵敏度适中，观察简易，凝胶背景很浅，后续蛋白质组学研究的兼容性好等优点，可以在制备蛋白质分子量标准品(marker)、优化Western-blot、或聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方式有较为广泛的应用前景。
【附图说明】
[0018]图15-氟胞嘧啶不同处理方法对蛋白质染色的结果图1A显示的是大肠杆菌总蛋白(泳道2-9)在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后使用紫外线激发后的结果图；M-蛋白分子量标准。
图1B显示的是在大肠杆菌总蛋白中加入5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离后紫外线激发后的检测结果图；M-蛋白分子量标准。
图1C显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液后，大肠杆菌总蛋白电泳结束后使用紫外线激发后的检测结果图；M-蛋白分子量标准。
图1D显示的是30%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺(29: I)与5-氟胞嘧啶溶液预混合后制备聚丙烯酰胺凝胶，
大肠杆菌总蛋白在电泳结束后使用紫外线激发后的检测结果图；M-蛋白分子量标准。
[0019]图25-氟胞嘧啶不同处理方法对蛋白质染色后再进行CBBR-250染色的结果
图2A显示的是大肠杆菌总蛋白(泳道2-9)在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后后使用紫外线激发观察后再经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；M-蛋白分子量标准。
图2B显示的大肠杆菌总蛋白中加入5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离后使用紫外线激发观察后经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；
图2C显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液后，大肠杆菌总蛋白电泳结束后使用紫外线激发观察后经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；图2D显示的是30%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺(29: I)与5-氟胞嘧啶溶液预混合后制备聚丙烯酰胺凝胶，大肠杆菌总蛋白电泳结束后使用紫外线激发观察后经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片。
图3 5-氟胞嘧啶浸泡蛋白质电泳凝胶后紫外光照射检测及CBB-R250染色的结果图3A聚丙烯酰胺泳结束后将凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色10分钟后用紫外光照射检测图；
图3B聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后将凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色10分钟后用紫外光照射检测后再经CBB-R250染色检测。
[0020]图4不同浓度的5-氟胞嘧啶对蛋白质染色的结果
图4A显示的是不同浓度的大肠杆菌总蛋白(泳道2-9)在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后使用紫外线激发后的结果；M-蛋白分子量标准。