一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及到食品安全相关的免疫分析检测技术， 提供了一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法，适用于牛奶、奶粉及饲料等样本 中三聚氰胺的定量检测。
【背景技术】
[0002] 三聚氰胺（Melamine，MEL)俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合 物，被用作化工原料，可用于塑料、涂料、粘合剂、食品包装材料的生产。它是白色单斜晶体， 几乎无味，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸、甘油等，对身体有害，不可用于食品加工或食品添 加物。对在食品中人为添加三聚氰胺的，依法追究法律责任。
[0003] 食品工业中常常需要检查蛋白质含量，业界常使用一种叫做"凯氏定氮法 (Kjeldahl method) "的方法，通过食品中氮原子的含量来间接推算蛋白质的含量。也就是 说，食品中氮原子含量越高，这蛋白质含量就越高。三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高 (66% )，所以常被不法商人添加到食品和饲料中以虚假提高蛋白质的含量，对人类及动物 健康造成了严重危害，三聚氰胺在生物体内无代谢转化，急性毒性很低，但长期食用会形成 泌尿结石，造成肾结石、肾损伤、肾功能衰竭，甚至膀胱癌。近年来，三聚氰胺污染食品导致 中毒事件时有发生。2008年的"问题奶粉"事件造成上万婴儿肾损伤甚至死亡，为确保人体 健康，确保乳与乳制品质量安全，卫生部发布25号公告制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临 时管理限量值，随后国务院发布施行《乳品质量安全监督管理条例》，加强乳品质量监管。
[0004] 目前市场上常用检测三聚氰胺试剂主要是采用胶体金免疫层析技术、酶联免疫技 术等分析方法，而实验室及检验中心多采用高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相 色谱-质谱联用法检测样本中三聚氰胺含量。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种三聚氰胺定量检测试剂盒。
[0006] 本发明提供的试剂盒，
[0007] 为 1)或 2):
[0008] 1)包括异硫氰酸荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶标记的三聚 氰胺抗原溶液和磁分离试剂；
[0009] 所述异硫氰酸荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体溶液和所述碱性磷酸酶标记三 聚氰胺抗原溶液的溶剂均为抗试剂缓冲液；
[0010] 所述抗试剂缓冲液按照如下方法制备：将溶液A、动物血清和防腐剂混匀得到抗 试剂缓冲液；
[0011] 所述溶液A由Na+、Mg 2+、Zn2+、Trizma base、动物血清白蛋白和水组成；
[0012] 2)包括所述异硫氰酸荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体、所述碱性磷酸酶标记三 聚氰胺抗原和所述抗试剂缓冲液。
[0013] 上述试剂盒中，所述抗试剂缓冲液中，所述动物血清为牛血清，所述防腐剂为 ProcLin-300 ；
[0014] 所述溶液A、所述牛血清和所述ProcLin-300的配比为1000 g : 2. 0~1 OmT,:0. 2-1. OmT,；
[0015] 所述溶液A中，所述Na+的浓度为0· 1-0. 5mol/L，所述Mg 2+的浓度为lmmol/L，所 述Zn2+的浓度为0. lmmol/L,所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0. 2-1. 0%;所述Trizma base 浓度为 20-100mmol/L。
[0016] 上述试剂盒中，所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、所述牛血清和所述 ProcLin-300 的配比为 1000 g :5mL:0. 5mL ;
[0017] 所述溶液A中，所述Na+源于NaCl，所述NaCl浓度为0· lmol/L ;
[0018] 所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0. 5% ;
[0019] 所述 Trizma base 的浓度为 50mmol/L〇
[0020] 上述试剂盒中，所述异硫氰酸荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体溶液由异硫氰酸 荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述异硫氰酸荧光素标记的 三聚氰胺单克隆抗体的浓度为〇. 1-0. 5 μ g/mL ;
[0021] 所述碱性磷酸酶标记三聚氰胺抗原溶液由碱性磷酸酶标记三聚氰胺抗原和所述 抗试剂缓冲液组成，所述碱性磷酸酶标记三聚氰胺抗原的浓度为〇. 2-1 μ g/mL。
[0022] 上述试剂盒还包括磁分离试剂；
[0023] 所述磁分离试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体共价连接在磁珠表面，得到磁分离试 剂；
[0024] 所述抗异硫氰酸荧光素抗体为多克隆抗体；
[0025] 所述抗异硫氰酸荧光素抗体和所述磁珠的配比为30 μ g-200 μ g :lmg ;
[0026] 所述磁珠的直径为0. 5-1. 5 μ m。
[0027] 上述试剂盒还包括校准品；
[0028] 所述校准品由η个不同浓度的校准品溶液组成，所述校准品溶液由三聚氰胺抗原 和校准品缓冲液组成，且所述三聚氰胺抗原在所述校准品中为不同浓度；η小于等于6 ;
[0029] 所述校准品缓冲液按照如下方法制备：将溶液B和防腐剂混匀得到；
[0030] 所述溶液B由二水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、NaCl和水组成，
[0031] 所述溶液B和所述防腐剂的配比为1000 g :0. 2-1. OmL ;
[0032] 所述溶液B中，所述二水磷酸二氢钠的浓度为2mmol/L，所述磷酸氢二钠浓度为 8mmol/L，所述NaCl质量百分含量为0. 2% -1. 0%。
[0033] 上述试剂盒中，所述防腐剂为ProcLin-300 ;
[0034] 所述溶液 B 和 ProcLin-300 的配比为 1000 g :0· 5ml ;
[0035] 所述溶液B中，所述NaCl的质量百分含量为0· 9 %。
[0036] 上述试剂盒还包括质控品、样本稀释液、清洗液和底物溶液；
[0037] 所述质控品为2个不同浓度的校准品；
[0038] 所述清洗液由吐温-20、氯化钠和浓度为0. 15M、pH为8. 0±0. 05的Tris-HCl缓冲 液组成，其中，所述吐温-20的体积百分含量为0. 04%，所述氯化钠的浓度为0. 25mol/L ;
[0039] 所述底物溶液由二氢吖啶和浓度为0· 25mol/LpH为8· 0±0· 05的Tris-HCl缓冲 液组成，其中，所述二氢吖啶的浓度为0. 25g/mL ;
[0040] 所述样本稀释液为校准品缓冲液。
[0041] 上述抗试剂缓冲液的pH值为7. 0 ±0· 05。
[0042] 上述校准品缓冲液的pH值为7. 2 ±0. 05。
[0043] 上述异硫氰酸荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体为用异硫氰酸荧光素标记三聚 氰胺单克隆抗体得到的产物；
[0044] 上述碱性磷酸酶标记三聚氰胺抗原为用碱性磷酸酶标记三聚氰胺抗原得到的产 物。
[0045] 上述校准品为浓度为0、l、3、9、27、100ng/mL三聚氰胺抗原溶液。
[0046] 上述质控品为浓度为3ng/mL和27ng/mL的校准品。
[0047] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述的试剂盒的方法。
[0048] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述试剂盒中8种组分均独立包装；再整体 包装为试剂盒。
[0049] 上述的试剂盒在三聚氰胺定量检测中的应用也是本发明保护的范围；
[0050] 或上述的试剂盒在制备三聚氰胺定量检测产品中的应用也是本发明保护的范 围；
[0051] 或上述的试剂盒中8种组分在制备三聚氰胺定量检测产品中的应用也是本发明 保护的范围；
[0052] 或本发明还保护一种待测样本中三聚氰胺定量检测方法，包括如下步骤：
[0053] 1)上述的试剂盒中样本稀释液稀释待测样本，得到稀释待测样本；
[0054] 2)将上述的试剂盒中的校准品、质控品和所述稀释待测样本分别与上述的试剂盒 中的异硫氰酸荧光素标记的三聚氰胺单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记三聚氰胺抗原溶 液混匀，反应，得到免疫反应产物；
[0055] 3)将所述免疫反应产物与上述的试剂盒中的磁分离试剂混匀，反应，得到反应产 物，将所述反应产物中的沉淀与磁珠清洗液混悬，收集沉淀，即为磁分离产物；
[0056] 4)将所述磁分离产物和上述的试剂盒中的底物溶液混匀，得到混合产物，用化学 发光仪检测所述混合产物的发光强度，通过发光强度计算待测样本中全量程三聚氰胺定 量；
[0057] 所述磁珠清洗液为将上述的试剂盒中清洗液与水按1:7混匀，得到溶液；
[0058] 或上述的试剂盒中磁分离试剂在三聚氰胺定量检测中的应用也是本发明保护的 范围。
[0059] 将如下8种组分独立包装后再整体包装为试剂盒，即为三聚氰胺定量检测试剂 盒：1、校准品（含一系列浓度的MEL，用于建立标准曲线）；2、质控品（含一定浓度的MEL); 3、试剂A(含一定浓度的异硫氰酸荧光素标记的MEL抗体溶液）；4、试剂B(含一定浓度的 碱性磷酸酶标记的MEL抗原溶液）5、样本稀释液（lOmmol/L磷酸盐（PBS)缓冲液，配方同 校准品缓冲液）；6、磁分离试剂（结合有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁珠混悬液）；7、清洗液 (用于配制磁珠清洗液）；8、底物溶液。试剂盒中1、2、3、4、5、6、8为必备试剂。
[0060] 本发明的实验证明，本发明具有以下优点：
[0061] 1、本发明中样本处理方法简单。样本稀释、提取等简单处理后即可用于检测，不需 过夜处理、过纯化柱、吹干等复杂的过程；
[0062] 2、本发明利用磁珠子与化学发光技术相结合，提供了一种检测范围宽、灵敏度高、 精密度好、测值稳定的定量检测方法，操作简单，检测快速，可满足快速、大量检测样本的需 求。
[0063] 本发明所采用的检测方法是磁珠分离化学发光免疫检测法，是酶标记技术，磁分 离技术和化学发光技术相结合，其操作方便、简单，反应条件温和，发光值稳定且受外界条 件影响较小。相