一种人肌钙蛋白i的超敏定量测定试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及临床检验领域，尤其是涉及一种测定人肌f丐蛋白I (Troponin I)含量 的试剂盒及其测试方法。
【背景技术】
[0002] 人肌钙蛋白由肌钙蛋白I、T、C三亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对 横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。肌钙蛋白I(TnI)是横 纹肌的一种关键调节蛋白。尽管所有横纹肌TnI的功能都相同，但心肌TnKcTnI，分子质量 23. 9kD)与骨骼肌TnI明显不同。
[0003] 由于组织特异性高，心肌肌钙蛋白I(CTnI)是心肌损伤的高敏感性标志物。CTnI 还可用于鉴别骨骼肌损伤（如横纹肌溶解、多发性损伤和非心脏手术）和心肌损伤。cTnl 已经明确是急性冠状动脉综合征（ACS)患者的预后标志物，可以预测近期、中期甚至长期 预后。
[0004] CTnI和CTnT已确定是预测ACS后果的最佳独立标志物。欧洲心脏病协会（ESC) 和美国心脏病学会（ACC)联合对心肌梗死（MI)进行了重新定义。根据此定义，在临床急性 缺血的情况下，当血中cTnl水平高于参考范围（健康人群）99百分位值时，即可诊断为MI。 同时要求肌钙蛋白检测方法的不精密度（变异系数X 10%。根据以上规定，如果一种检 测方法在CV小于10%的前提下，可以测量到99%分位或更低的数值，我们就可以称之为超 敏肌钙蛋白。应用第99百分位数参考上限时，其临界值为0. 02ng/ml，而在CV < 10%时， 最低测量值至少应不大于〇. 〇15ng/ml。
[0005] 根据MI的重新定义，已经发表了许多关于心肌肌钙蛋白检测在ACS患者中的作用 的建议。在UAP和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI)患者中，检测到的心肌肌钙蛋白水平与 高死亡率有关。因此，肌钙蛋白的检测对这些患者的危险分级非常有用，也是ACC/AHA (美 国心脏病学会）对UAP和NSTEMI患者处理导则的一部分。cTn具有相当长的诊断窗口期 (cTnl 7至9天，CTnT更长），因此很快检测出结果很重要。从检测角度上来说，目前临床 上用于测定cTnl的方法主要有放免法、胶体金免疫层析法、ELISA法、化学发光法等。化学 发光法检测时间短、灵敏度高、准确性高。
[0006] 磁微粒酶促化学发光检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒 分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法， 抗原、抗体的结合反应是在固相（ELISA板反应孔）表面进行的。磁微粒分离酶联免疫检测 方法，抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA 相比具有灵敏度高，检测用时少等优点。
【发明内容】
[0007] 因此，根据本申请的一方面，提供一种肌钙蛋白I的检测试剂盒，其包含：表面上 结合有第一抗cTnl单克隆抗体的磁微粒；表面上结合有第二抗cTnl单克隆抗体的磁微粒； 酶标记的第三抗cTnl单克隆抗体；和/或酶标记的第四抗cTnl单克隆抗体，其中所述第 一、第二、第三和第四单克隆抗体分别特异于人肌钙蛋白I的不同表位。
[0008] 在具体的实施方式中，第一和第二抗cTnl单克隆抗体共价结合至磁微粒的表面。 在具体的实施方式中，第一和第二抗cTnl单克隆抗体可以结合到同一磁微粒上，也可以分 别结合至不同的磁微粒上。在具体的实施方式中，第一和第二抗cTnl单克隆抗体各自独立 地包被到磁微粒上。
[0009] 在一些具体的实施方式中，采用碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶来标记抗CTnI 单克隆抗体；优选采用碱性磷酸酶标记第三和第四抗cTnl单克隆抗体。
[0010] 在一些具体的实施方式中，本申请的试剂盒还包含碱性磷酸酶的底物、或者辣根 过氧化物酶的底物。本领域技术人员公知的任何适当底物都是允许的；作为非限制性的实 例，例如但不限于二氧杂环乙烧、二氧杂环乙烷类似物、鲁米诺、鲁米诺衍生物。
[0011] 在一些实施方式中，本申请的试剂盒还包含洗涤液，所述洗涤液包含TriS-HCl缓 冲液和吐温80。优选地，洗涤液含有吐温80、NaCl、Proclin-300和Tris-HCl缓冲液。在 一些具体的实施方式中，所述吐温80的浓度为0. 5g/L至2g/L。在优选的实施方式中，吐温 80的浓度为0· 8g/L至lg/L。
[0012] 在一些实施方式中，第一抗cTnl单克隆抗体在试剂中的浓度是3.2 μ g/ml ;第二 抗cTnl单克隆抗体在试剂中的浓度是3. 2 μ g/ml。
[0013] 在一些实施方式中，第三抗cTnl单克隆抗体在试剂中的浓度是I. 6 μ g/ml ;第四 抗cTnl单克隆抗体在试剂中的浓度是1. 6 μ g/ml。
[0014] 在一些实施方式中，磁颗粒的粒径是0. 5至3. 5 μπι ;优选1至3 μπι。
[0015] 在一些实施方式中，第一和第二抗cTnl单克隆抗体位于相同的容器中。第三和第 四抗cTnl单克隆抗体位于相同的容器中。第一和第二抗cTnl单克隆抗体与第三和第四抗 cTnl单克隆抗体位于不同的容器中。
[0016] 在具体的实施方式中，本申请的试剂盒包含或者由如下组成：(a)磁分离试剂、 (b)酶标记试剂和（c)底物；其中磁分离试剂包含表面上结合有第一抗cTnl单克隆抗体的 磁微粒和表面上结合有第二抗cTnl单克隆抗体的磁微粒；所述酶标记试剂包含酶标记的 第三抗cTnl单克隆抗体和酶标记的第四抗cTnl单克隆抗体；所述底物包含鲁米诺或其衍 生物。
[0017] 另一方面，本申请提供一种改善肌钙蛋白I的检测灵敏度的方法，其包括如下步 骤：(a)将表面上结合有第一抗cTnl单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗cTnl单 克隆抗体的磁微粒混合；以及（b)将酶标记的第三抗cTnl单克隆抗体和酶标记的第四抗 cTnl单克隆抗体混合；以及任选地（c)将上述步骤所得的混合物和待测样本接触；其中所 述第一、第二、第三和第四单克隆抗体分别特异于人肌钙蛋白I的不同表位；步骤（a)和步 骤（b)顺序是可互换的。
[0018] 在具体的实施方式中，表面上结合有第一抗cTnl单克隆抗体的磁微粒和表面上 结合有第二抗cTnl单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1进行混合。结合有第三抗cTnl单 克隆抗体的磁微粒和所述表面上结合有第四抗cTnl单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1 进行混合。
[0019] 又一方面，本申请提供一种制备本申请所述检测试剂盒的方法，其包括如下步骤： 将表面上结合有第一抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗人肌钙 蛋白I单克隆抗体的磁微粒混合；以及将酶标记的第三抗人肌钙蛋白I单克隆抗体和酶标 记的第四抗人肌钙蛋白I单克隆抗体混合，其中所述第一、第二、第三和第四单克隆抗体分 别特异于人肌钙蛋白I的不同表位。在具体的实施方式中，表面上结合有第一抗CTnI单克 隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗cTnl单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1进行混 合。结合有第三抗cTnl单克隆抗体的磁微粒和所述表面上结合有第四抗cTnl单克隆抗体 的磁微粒，按照质量比1:1进行混合。
【附图说明】
[0020] 图1 :本申请试剂盒和对比试剂的相关性（横纵坐标的单位为ng/ml，横坐标为对 比试剂的测值，纵坐标为本申请试剂盒测值）。
【具体实施方式】
[0021] 实施例
[0022] 实施例1.磁分离试剂的制备过程
[0023] 一、试剂的配制操作步骤：
[0024] 1、结合缓冲液：
[0025] 称取2L 32g MES加约800ml纯水使之溶解，过后用NaOH调pH至5. 0,定容至1L。
[0026] 2、清洗液：
[0027] 称取Tris 3. 025g、NaCl 9g加约800ml纯水使之溶解，过后用HCl调pH至L 2后， 加入0· 5g Tween-20混勾后，定容至IL0
[0028] 3、交联试剂：
[0029] 含10mg/ml EDC的冰冷结合缓冲液，临用现配。
[0030] 4、封闭液：
[0031] Biolipidure-203 或 _206〇
[0032] 5、储存液：
[0033] 称取Tris (λ 605g、NaCl 0· 9g加约80ml纯水使之溶解，过后用HCl调pH至7. 2 后，加入 〇· Ig BSA、0.1 g Tween-20 混勾后，定容至 100mL0
[0034] 二、磁分离试剂的制备过程
[0035] 1、将磁颗粒EMl-100140(Merck，粒径0. 93 μπι，也允许使用其它市售等同磁颗粒， 如Thermo的产品）重悬后取Iml于15ml离心管中。
[0036] 2、置于磁力架上磁分离Imin后小心移走上清。
[0037] 3、加入IOml结合缓冲液充分重悬磁颗粒后，置于磁力架上磁分离Imin后小心移 走上清，此步重复二次。
[0038] 4、加入IOml结合缓冲液充分重悬磁颗粒后，加入1ml交联试剂混匀，室温避光混 勾反应30min。
[0039] 5、置于磁力架上磁分离Imin后小心移走上清。
[0040] 6、加入IOml结合缓冲液清洗一次，置于磁力架上磁分离Imin后小心移走上清，加 入IOml结合缓冲液后加入I. 5mg第一抗cTnl单克隆抗体（购自Hytest，货号916)混勾， 室温避光混匀反应3h。
[0041] 7、加入IOml清洗液清洗磁颗粒3次，最后一次移走上清后加入5ml封闭液混匀， 室温避光混匀反应过夜。
[0042] 8、加入IOml清洗液清洗三次。
[0043] 9、加入IOml储存液混匀后4°C储存。
[0044] 第二抗cTnl单克隆抗体（购自Hytest，货号3C7)按照上述步骤1至9进行同样 包被。
[0045] 实施例2.酶标记抗体制备过程
[0046] 一、试剂的配置步骤：
[0047] U0.1 M PBS pH 7. 4 ：
[0048] 称取 ΚΗ2Ρ042· 4g、Na2HP0414. 4g、NaCl 8g、KCl 0· 2g 加 800ml 纯水溶解后，