生物素链霉亲和素与电化学联用检测霉菌毒素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种生物素链霉亲和素与电化学联用检测霉菌毒素的方法
【背景技术】
[0002]霉菌毒素(Mycotoxins)广泛存在于霉变的粮食和饲料中，是霉菌产生的小分子次级代谢产物。由于全球的主要农作物如玉米、大麦、小麦等均可被霉菌毒素污染，因此建立霉菌毒素的高灵敏度检测方法成为世界各国食品安全领域的重要内容，中国是农业大国，开展对霉菌毒素的有效检测和监管是保持国民经济和社会发展的重要方面。霉菌毒素种类繁多，最常见的有赭曲霉毒素A、呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、玉米赤霉稀酮、展青霉毒素和T-2毒素等。霉菌毒素一般均具有较强的毒性，可引起癌症、后代畸变、性早熟等疾病。
[0003]最常见的霉菌毒素检测手段主要是质谱法和酶联免疫法(ELISA)，质谱法由于复杂的样本前处理和依赖昂贵仪器的支持，不能得到广泛应用，而酶联免疫法由于操作简单，结果易获取，现已成为检测霉菌毒素污染最为常用的一种方法。酶联免疫法的原理是基于抗原与特异性抗体的结合，不同检测样本对霉菌毒素的限量标准不同，某些特殊样本，如婴幼儿食品，对霉菌毒素的限量显著低于普通食品，并且某些霉菌毒素毒性相差很大，微量即可造成动物机体的严重伤害，如赭曲霉毒素、黄曲霉毒素等。常规的酶联免疫法仅仅通过酶标抗体进行检测信号的放大，受制于霉菌毒素单克隆抗体的亲和活性的限制，而霉菌毒素属于小分子半抗原，本身不具备免疫原性，高亲和性抗体难以获得并且成本较高，本发明采用了生物素链霉亲和素信号放大系统与电化学联用检测霉菌毒素的方法，使得检测的灵敏度大大提高，适应样本的快速痕量检测，为霉菌毒素检测提供新平台。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有酶标免疫信号放大手段的不足，提供了一种生物素链霉亲和素信号放大与电化学联用检测霉菌毒素的方法。
[0005]为解决相关技术问题，本发明的解决方案是:提供一种生物素链霉亲和素与电化学联用检测霉菌毒素的方法，是在常规间接竞争ELISA反应的基础上，将霉菌毒素特异性抗体进行生物素标记，并用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素代替传统的酶标二抗，借助生物素链霉亲和素信号放大系统进行检测灵敏度的提高；选用硝基苯磷酸(PNPP)作为碱性磷酸酶的催化底物，由于其产物硝基苯酚(PNP)具有电化学性质而底物硝基苯磷酸(pNPP)不具备，二者不会形成信号的相互干扰，可通过电化学方法(丝网印刷电极)采集最终产物的氧化峰值；数据处理时，以梯度稀释的霉菌毒素标准品浓度对数为横坐标，以相应浓度的氧化峰值与O标准品的阳性对照峰值的比值为纵坐标，绘制标准抑制曲线；最终，根据标准曲线计算实际样本中待检霉菌毒素的含量。
[0006]本发明中，所述待检霉菌毒素是赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、呕吐毒素中的任意一种。
[0007]本发明中，该方法的具体实现步骤包括:
[0008](I)利用常规聚乙稀96孔板(corning，3590)，霉菌毒素偶联抗原以最佳包被浓度进行稀释，稀释液为pH = 9.6的碳酸盐缓冲液；100 μ I/孔加入，4°C过夜，用含0.05% (v/v) Tween20的0.0IM磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤后，加入200 μ I含5% (w/v)脱脂奶粉(PBST配置)，37°C封闭2h，洗涤后甩干备用；
[0009](2)将50 μ I梯度稀释的霉菌毒素标准品、待检样本与50 μ I稀释到最佳浓度的生物素标记的霉菌毒素单克隆抗体混匀后，分别加入96孔板，每个浓度做3个平行，并同时设置阴性和阳性对照；阳性对照为50 μ I霉菌毒素标准品稀释液与50 μ I生物素标记霉菌毒素单克隆抗体混匀，阴性对照为50 μ I霉菌毒素标准品稀释液与50 μ I生物素标记霉菌毒素单克隆抗体稀释液混匀；37°c作用30min后，PBST洗涤后置于吸水纸上扣干备用；
[0010](3)加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(0.5 μ g/ml)，100 μ I/孔，37°C作用30min后，PBST洗涤后置于吸水纸上扣干备用；
[0011](4)加入 1mM 的硝基苯磷酸(pNPP)，稀释液为 50mM 的 Tris HCl,0.1M NaCl, pH=8.5，100 μ I/孔，37°C作用1min后，将孔中溶液转移到EP管中并做好标记；
[0012](5)将EP管中的的溶液取出80 μ I加到丝网印刷电极上，测定反应产物的氧化峰电流，扫描范围0V-1.2V，振幅为80mV，脉冲宽度0.01s，采样宽度0.0025s，脉冲周期0.1s ;
[0013](6)以梯度稀释的霉菌毒素标准品浓度对数为横坐标，相应浓度的峰电流值与O标准品阳性对照峰电流的比值为纵坐标，绘制标准抑制曲线，根据标准曲线，计算实际样本中待检霉菌毒素的含量。
[0014]本发明中，步骤(I)中所述的霉菌毒素偶联抗原最佳包被浓度与步骤(2)中所述的生物素标记的霉菌毒素单克隆抗体的最佳浓度，是通过下述方法确认的:
[0015]利用96孔聚乙烯板(Corning，3590)，以pH = 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)对霉菌毒素偶联抗原进行梯度稀释后，以100 μ I/孔加到板中，4°C包被过夜；弃去上清，用PBST洗涤未结合的偶联抗原后，加入200 μ I含5% (w/v)脱脂奶粉(PBST配置)，在37°C封闭2h，洗涤后，加入梯度稀释后的生物素标记霉菌毒素单克隆抗体，100 μ I/孔，37°C作用30min后，弃去上清液，洗去未特异性结合的抗体，加入0.2 μ g/ml的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，100 μ I/孔)，37°C作用30min后洗涤并置于吸水纸上扣干，加入现配的1mM对硝基苯磷酸(PNPP)，100 μ I/孔，37°C作用1min ;由于产物硝基苯酚(pNP)在405nm处有特殊的吸收峰，按50 μ I/孔加入2Μ氢氧化钠终止后，酶标仪OD4ffi读数后选取若干数值接近1.0的霉菌毒素偶联抗原包被浓度与生物素标记霉菌毒素单克隆抗体作用浓度组合，分别绘制常规间接ELISA标准曲线，具体操作方法为:96孔聚乙烯板(Corning，3590)包被霉菌毒素偶联抗原，按照上述所述操作封闭处理后备用，洗涤封闭后，取50 μ I梯度稀释的霉菌毒素标准品与50 μ I稀释后的生物素标记的霉菌毒素单克隆抗体进行预混后加入反应孔中，37°C作用30min，并同时设置阴性与阳性对照(阴性对照:50 μ I霉菌毒素标准品稀释液与50 μ I生物素标记的霉菌毒素单克隆抗体稀释液混匀后加入反应孔；阳性对照:50 μ I霉菌毒素标准品稀释液与50 μ I生物素标记的霉菌毒素单克隆抗体混匀后加入反应孔中)，作用后洗涤并置于吸水纸上扣干，加入0.2 μ g/ml的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，100 μ I/孔，37°C作用30min后，PBST洗涤后置于吸水纸上扣干；加入1mM的硝基苯磷酸(pNPP)，稀释液为 50mM 的 Tris HCl，0.1M NaCl，pH = 8.5，100 μ I/孔，37°C作用 1min 后用 50μ1，2Μ氢氧化钠终止反应，酶标仪OD4id5读数，以梯度稀释的霉菌毒素标准品浓度对数为横坐标，以对应的吸光度比值(标准品0D45。-阴性孔0D4J/(阳性孔0D45。-阴性孔0D45。)为纵坐标绘制标准抑制曲线，对所得的若干标准曲线进行分析，分别计算半数抑制率即吸光度比值为0.5 (IC50)所对应的霉菌毒素标准品浓度，选取最低值所对应的霉菌毒素偶联抗原包被与生物素标记霉菌毒素单克隆抗体作用浓度作为检测时的最佳浓度组合。
[0016]发明原理描述:
[0017]本发明首先建立基于生物素链霉亲和素信号放大系统的ELISA体系，并优化得到最佳的的霉菌毒素偶联抗原包被与生物素标记霉菌毒素单克隆抗体的作用浓度。碱性磷酸酶(ALP)的底物采用对硝基苯磷酸(pNPP)，由于碱性磷酸酶可以将无色的pNPP转换为黄色产物对硝基苯酚(