一种基于二硫化钼/镍钯合金纳米复合材料构建的无标记电化学免疫传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于无机纳米复合材料构建的无标记电化学免疫传感器的制备 方法，所制备的传感器可用于胃癌肿瘤标志物的检测。属于新型纳米功能材料与生物传感 器技术领域。
【背景技术】
[0002] 胃癌患者的诊断主要的方法之一就是检测胃癌肿瘤标志物，因此，研发灵敏、特异 性高的检测胃癌肿瘤标志物的传感器具有重要意义。
[0003] 电化学免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临 床分析和环境检测领域，其中，无标记电化学免疫传感器因其制备相对简单、受环境影响小 等优点，具有更广阔的应用前景。构建无标记电化学免疫传感器，关键的技术是提高修饰电 极对抗体的固定量和对测试底液的信号响应速度和大小。
[0004] 二硫化钼，化学式为MoS2,英文名称为molybdenum disulfide，是辉钼矿的主要成 分，是应用最广泛的固体润滑剂之一。其纳米二维结构，是性能优异的半导体纳米材料，除 了具有大的比表面积，可以作为催化剂和生物抗体的载体，提高负载量，同时作为助催化剂 也具有优良的电子传递性能。
[0005] 目前，大多数的合成手段都是分开合成后，再将催化剂与载体进行复合，过程繁 琐，产率不高。因此，对于一锅法制备具有优良催化性能的催化剂具有广泛的应用前景和重 要的科学意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、特异性强的可用于胃癌肿瘤标 志物检测的电化学无标记免疫传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于胃癌肿瘤标志 物的灵敏检测。基于此目的，本发明先采用一锅法制备出二硫化钼/镍钯合金纳米复合材 料M 〇S2/NiPd，并利用其对电极进行修饰，有效提高了电极的比表面积，增大了抗体的吸附 量；并且极大增强了电极的电子响应速度和对测试底液的电催化信号强度等性能；然后通 过吸附作用，固定胃癌肿瘤标志物抗体。在进行检测时，利用抗体与抗原的特异性定量结 合，使得电极对H 2O2的电流响应信号相应降低，从而实现了采用无标记的电化学方法检测 胃癌肿瘤标志物的免疫传感器的构建。
[0007] 本发明采用的技术方案如下： 1. 一种基于二硫化钼/镍钯合金纳米复合材料构建的无标记电化学免疫传感器的制 备方法，其特征在于，制备步骤为： (1)取35 mL的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液，加入0. 02~0. 06 g六水合二氯化镍 NiCl2WH2O和2~6 mL的氯钯酸H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入2~6 mL 的抗坏血酸溶液，0. 5~1. 5 mL的钼酸钠 Na2MoO4溶液和0. 01~0. 03 g硫化钠 Na 2S，搅拌15 分钟后，放入反应爸中，在150~220°C下，反应12~16小时；冷却至室温后，使用去离子水离 心洗涤，在40 °C下进行真空干燥，即制得二硫化钼/镍钯合金纳米复合材料M〇S2/NiPd，将 其溶于去离子水制得M 〇S2/NiPd溶液； (2) 以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5~12 PL的M〇S2/NiPd溶液， 室温下晾干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用去离子水清洗，室温下晾干成膜，在电极表面滴涂5~12 KL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 °C冰箱中保存晾干； (4) 将步骤（3)中得到的电极用去离子水清洗，继续在电极表面滴涂5~10 PL的牛血清 白蛋白BSA溶液，4 °C冰箱中保存晾干，用去离子水清洗，4 °C冰箱中晾干成膜，制得无 标记电化学免疫传感器； 所述的CTAB溶液的浓度为0· I mol/L，所述的H2PdCl4浓度为0.03 mol/L，所述的抗坏 血酸溶液浓度为〇· 3 mol/L，所述的似#〇04溶液浓度为0· I mol/L ; 所述的MoS2/NiPd溶液浓度为I mg/mL ; 所述的胃癌肿瘤标志物抗体溶液浓度为10 Kg/mL ; 所述的BSA溶液浓度为100 Pg/mL。
[0008] 2.本发明所述的制备方法所制备的无标记电化学免疫传感器，其特征在于，所述 的无标记电化学免疫传感器的用途为可用于胃癌肿瘤标志物的快速、灵敏检测。
[0009] 3.本发明所述的无标记电化学免疫传感器的用途，其特征在于，检测胃癌肿瘤标 志物的检测步骤为： (1) 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶 液，底液为pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液； (2) 工作电极修饰：将本发明所述的无标记电化学免疫传感器作为工作电极，将步骤 (1)中配制的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 °C冰箱中 保存； (3) 工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步 骤（2)所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入 10~25mL pH=7. 0~8. 0的PBS缓冲溶液和20 PL浓度为3~6 mol/L的氏02;通过计时电流法 检测组装的工作电极对H2O2的响应；空白标样的响应电流记为/。，含有不同浓度的胃癌肿 瘤标志物标准溶液的响应电流记作J 1，响应电流降低的差值为A /= T0-J1, Δ /与胃癌肿瘤 标志物标准溶液的质量浓度Ct间成线性关系，绘制△ /一 CC作曲线； (4) 胃癌肿瘤标志物的检测：用待测样品代替步骤（1)中的胃癌肿瘤标志物标准溶液， 按照步骤（2)和（3)中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值工作曲线，得到待 测样品中胃癌肿瘤标志物的含量。
[0010] 4.本发明所述的无标记电化学免疫传感器的用途，其特征在于，所述的胃癌肿瘤 标志物选自下列胃癌肿瘤标志物之一：CA-199、CA-242或CA-724。
[0011] 本发明的有益成果 (1)本发明所述的胃癌肿瘤标志物免疫传感器制备简单，操作方便，可以实现对样品的 快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前景。
[0012] (2)本发明首次采用一锅法制备了 M〇S2/NiPd，并将其应用于电化学免疫传感器的 制备中，利用M〇S2/NiPd的大比表面积以增大抗体的吸附量、高催化活性以提高电化学响应 信号强度及其高电子传递速率以提高电化学响应信号速度，显著增强了电极对H2O2的响应 速度和强度，大大提高了电化学传感器的检测灵敏度，具有重要的科学意义和应用价值。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1 MoS2/NiPd的制备方法 取35 mL浓度为0.1 mol/L的CTAB溶液，加入0. 02 g的NiCl2 · 6H20和2 mL浓度为 0· 03 mol/L的H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入2 mL浓度为0· 3 mol/ L的抗坏血酸溶液，0. 5 mL浓度为0.1 mol/L的Na2MoO4溶液和0. 01 g的Na 2S，搅拌15分 钟后，放入反应釜中，在180°C下，反应14小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在 40 °C下进行真空干燥，即制得M〇S2/NiPd，将其溶于去离子水制得浓度为I mg/mL的MoS2/ NiPd溶液。
[0014] 实施例2 MoS2/NiPd的制备方法 取35 mL浓度为0.1 mol/L的CTAB溶液，加入0. 04 g的NiCl2 · 6H20和4 mL浓度为 0.03 111〇1/1的H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入4 mL浓度为0.3 mol/ L的抗坏血酸溶液，1. 0 mL浓度为0.1 mol/L的Na2MoO4溶液和0. 02 g的Na 2S，搅拌15分 钟后，放入反应釜中，在150°C下，反应16小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在 40 °C下进行真空干燥，即制得M〇S2/NiPd，将其溶于去离子水制得浓度为I mg/mL的MoS2/ NiPd溶液。
[0015] 实施例3 MoS2/NiPd的制备方法 取35 mL浓度为0.1 mol/L的CTAB溶液，加入0. 06 g的NiCl2 · 6H20和6 mL浓度为 0· 03 mol/L的H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入6 mL浓度为0· 3 mol/L 的抗坏血酸溶液，I. 5 mL浓度为0.1 mol/L的Na2MoO4溶液和0. 03 g的Na 2S，搅拌15分 钟后，放入反应釜中，在220°C下，反应12小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在 40 °C下进行真空干燥，即制得M〇S2/NiPd，将其溶于去离子水制得浓度为I mg/mL的MoS2/ NiPd溶液。
[0016] 实施例4无标记电化学免疫传感器的制备方法 (1) 以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5 PL实施例1中制得的 M〇S2/NiPd溶液，室温下晾干； (2) 将步骤（1)中得到的电极用去离子水清洗，室温下晾干成膜，在电极表面滴涂5 PL 浓度为10 Kg/mL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 °C冰箱中保存晾干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用去离子水清洗，继续在电极表面滴涂5 PL浓度为100 Pg/mL的BSA溶液，4 °C冰箱中保存晾干，用去离子水清洗，4 °C冰箱中晾干成膜，制得无 标记电化学免疫传感器。
[0017] 实施例5无标记电化学免疫传感器的制