改良凝胶电泳检测血清前β1高密度脂蛋白的方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，是改良凝胶电泳检测血清前β 1高密度脂 蛋白的方法和应用。
【背景技术】
[0002] 血清前β 1高密度脂蛋白（prei3 1-HDL)是一种新生的HDL，在胆固醇逆转运过 程中发挥着重要功能，具有抗动脉粥样硬化的作用。但是令人费解的是，临床资料显示 prei3 I-HDL在冠心病患者中的含量显著升高，而不是负相关的关系。问题的关键在于方法 学存在缺陷，以往应用的梯度凝胶电泳（GGE)是以线性浓度梯度为基础，结果不能区分游 离的载脂蛋白Apo A1，因此不能准确检测pre β 1-HDL。
[0003] 以往线性GGE应用于二维凝胶电泳，联合免疫印迹技术检测pre β 1-HDL。美国波 士顿Tufts大学的Asztalos建立的方法发表于1993年，后来广为所用。经Boston Heart Diagnostics公司开发用于Boston Heart HDL Map')的核心技术。20余年来该项技术的应 用带来经济效益，同时影响本领域学术界对pre β I-HDL的认识，以致成为本行业内公认的 经典。然而，2014年Miyazaki报道两维电泳技术检测的pre β I-HDL实质是一种游离的Apo Al单体。显而易见，因为无法区分游离的Apo Α1，该项技术存在致命缺陷，长期以来对于 pre β I-HDL的认识一直存在概念上的混淆，导致错误地认为具有保护作用的pre β I-HDL 的含量在冠心病患者中反而显著升高。另外，线性梯度的凝胶（如2%-36%)在制备中 需要特殊的混合装置，稳定性也不如非线性梯度的设置。实施电泳时间往往要24h。定量 方法应用 1251，需要严格的放射性实验条件。由此可见，工序复杂，操作耗时，且无法避免放 射性问题，成为该法难以克服的缺点。参考：http://www. bostonheartdiagnostics. com/ science-portfolio-map-test. php〇
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供非线性梯度凝胶和/或苏丹黑B染 色液在精准分离和定量分析血清prei3 I-HDL中的应用。
[0005] 本发明的第二个目的是，提供一种精准分离和定量分析血清pre β I-HDL的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：非线性梯度凝胶和/或苏丹黑B染色 液在精准分离和定量分析血清pre β I-HDL中的应用，所述的非线性梯度凝胶是由三段浓 度依次为3. 0%、3. 6%和7.0%的聚丙烯酰胺凝胶共同组成，所述的苏丹黑B染色液中苏丹 黑B的浓度为0. 5-1. Ow/ν%，溶剂异丙醇和乙二醇的体积比为4:1。
[0007] 所述的非线性梯度凝胶分别作为一维非线性梯度管状凝胶体系和二维非线性梯 度平板凝胶体系分离血清pre β I-HDL的电泳介质，所述的一维非线性梯度管状凝胶体系 分离苏丹黑B预染色的血清pre β 1-HDL。
[0008] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种精准分离和定量分析血 清pre β I-HDL的方法，采用非线性梯度凝胶精准分离和定量分析血清pre β 1-HDL，其中非 线性梯度凝胶是由三段浓度依次为3. 0%、3. 6%和7. 0%的聚丙烯酰胺凝胶共同组成。
[0009] 所述的非线性梯度凝胶分别作为一维非线性梯度管状凝胶体系和二维非线性梯 度平板凝胶体系分离血清pre β I-HDL的电泳介质。
[0010] 采用一维非线性梯度管状凝胶体系分离苏丹黑B预染色的血清pre β 1-HDL，所述 的苏丹黑B染色液中苏丹黑B的浓度为0. 5-1. Ow/v %，溶剂异丙醇和乙二醇的体积比为 4:1〇
[0011] 所述的三段浓度依次为3. 0%、3. 6%和7. 0 %的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶，对 应的胶层高度分别为7mm、40mm和45mm，误差范围为± 3mm，三层分离胶的总高度为82mm，误 差范围± 5mm。
[0012] 所述的非线性梯度凝胶在一维管状凝胶体系中的规格为内径6_8mm，外径 8-10mm，非线性梯度凝胶在二维平板凝胶体系中的规格为厚度为2-3mm，宽度为60-80mm。
[0013] 所述的一维非线性梯度管状凝胶体系分离苏丹黑B预染色的血清pre β 1-HDL，电 泳缓冲液为5mM Tris和38. 4mM甘氨酸，电泳条件为100V，2. 5h，电泳后将迀移距离原点 65-75mm处孤立的染色区带定义为preP I-HDL ;所述的二维非线性梯度平板凝胶体系分离 血清pre β 1-HDL，电泳缓冲液为5mM Tris和38. 4mM甘氨酸，电泳条件为100V，3. 5h，电泳 后将pre β泳道上迀移距离原点65_75mm处印迹区带定义为pre β I-HDL和游离的Apo Al 多聚体，迀移距离原点80-90mm处印迹区带定义为游离的Apo Al单体。
[0014] 所述的二维非线性梯度平板凝胶体系分离血清pre β 1-HDL，电泳前在加样区加入 少量酚红溶液作为电泳指示剂。
[0015] 所述的一维非线性梯度管状凝胶体系分离苏丹黑B预染色的血清pre β 1-HDL，采 用光密度扫描定量，以空白凝胶扫描值为统一参比，计算出prei3 I-HDL占血脂总体的百分 含量；二维非线性梯度平板凝胶体系分离血清pre β 1-HDL、游离的Apo Al单体和多聚体， 采用免疫印迹、化学发光和胶片成像技术进行定性，在同一批内比较其相对含量。
[0016] 本发明优点在于：
[0017] 1、本发明建立了一维非线性GGE的方法，采用三段浓度分别为3. O %、3. 6 %和 7. 0%的聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质，清晰地将苏丹黑B染色的血清分离出一种特殊的 HDL 亚类，即 pre β 1-HDL ;
[0018] 2、本发明还建立了二维非线性GGE的方法，能够非常清晰地将pre β I-HDL和游离 的Apo Al分离开；
[0019] 3、本发明的非线性浓度梯度独立分层的制备过程简单易行，不需要特殊混合装 置；实施电泳仅需< 3. 5h ;定量方法无需放射性物质。本发明建立的非线性GGE能够精准 检测pre β 1-HDL，在性能上具有明显的优越性，并且是目前唯一可行的方法。
【附图说明】
[0020] 图1. 一维非线性GGE-亲脂性SBB染色图谱。Α: -维非线性梯度管状凝胶的示意 图。Β:重复性实验结果。pre β I-HDL的电泳迀移距离原点70mm，呈现清晰的SBB染色区 带。相同血样检测prei3 I-HDL的变异系数是2. 31%，说明该法有很好的重复性。C:临床 血样一维非线性GGE-亲脂性SBB染色图谱。pre β I-HDL在新生儿脐带血中含量丰富，而在 急性心梗患者和CETP变异者中的含量低于健康成人。D:电泳扫描图谱。
[0021] 图2.二维非线性GGE-免疫印迹图谱。A:二维非线性梯度平板凝胶的制备示意 图。B:二维电泳后血清中含有Apo Al颗粒的免疫印迹图谱。在preP泳道上电泳迀移大 约70mm的区带为pre β I-HDL (包含Apo Al多聚体），电泳迀移大约85mm的区带为游离的 Apo Al单体，清晰可见孤立的印迹区带。新生儿血样的图谱表现较成人复杂。C:二维非线 性GGE-免疫印迹示意图。箭头表示一向（ID)和二向（2D)的电泳方向。
[0022] 图3. pre β I-HDL的实验论证：颗粒密度和体外衍变。A:超速离心分离血清HDL。 Β:从超速离心后不同密度范围取样，经SBB染色后进行一维非线性GGE。pref3 I-HDL出现 在I. 210g/ml的密度液中，电泳迀移70mm。C:二维非线性GGE-免疫印迹图谱，preP I-HDL 同样出现在1.210g/ml的密度液中，迀移位置同样在70mm处。D:DTNB体外抑制实验。正常 血清体外37°C水浴6h后，pre β I-HDL的含量逐渐减少，这种颗粒的衍变能够被DTNB完全 抑制。因为DTNB是卵磷脂胆固醇酰基转移酶的抑制剂，能够有效抑制新生的pre β I-HDL 向大颗粒HDL衍变，所以结果进一步说明，这种电泳迀移70mm且能够被亲脂性SBB染色的 孤立电泳区带实质上是pre β 1-HDL。
[0023] 图4. pre β I-HDL的实验论证：颗粒大小和化学构成。Α:血清HDL的电子显微 图谱。箭头所指为prei3 1-HDL。B:血清HDL的Apo Al和胆固醇的相对重量比，其中在 pre β I-HDL的比值最高。
[0024] 图5. pre β I-HDL的实验论证：临床病例对照图谱。Α-Β:急性心梗患者和健康对 照血清的典型二维非线性GGE-免疫印迹图谱。急性心梗患者pre β I-HDL的含量较健康对 照明显减少。因为prei3 I-HDL具有抗动脉粥样硬化保护作用，所以这样的结果顺理成章。 C = Tangier病患者和健康对照血清的一维非线性GGE-亲脂性