用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法及其缓冲溶液的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本申请设及微生物质谱鉴定领域，尤其设及一种用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白 质处理方法及其缓冲溶液。
【背景技术】
[0002] 未知微生物的鉴定技术发展由久W来，通常在描述微生物鉴定结论中最基本的单 位为属和种。分类单位中最小的单位菌株是来自同一单个细胞的后代纯培养。传统的做法 是利用化学方法进行细菌的鉴定，有时候也称之为细菌化学分类。分类的标准可依据若干 多个化学分类指标，可W依据某些组分的有无，或者某些化合物丰度的比率，来获得一个显 著的分类指纹图谱。
[0003] 随着化学仪器的发展，该领域的先驱者化therine化nselau所著ACSSymposium Series将所有发展的质谱技术用于细菌化学分类。当基质辅助激光解析离子化 (Matrix-assistedlaserdeso;rptionionization,MALDI)成功的应用到蛋白质组学时， 开始有人利用该技术分析细菌蛋白质，其中包括可W用于细菌分类的蛋白质。
[0004] 基质辅助激光解析离子化（MLDI)是众多气化和离子化方法之一，飞行时间质量 分析器灯0巧是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而 被检测即测定离子的质荷比（M/幻与离子的飞行时间成正比，从而检测离子。MLDI-T0F 实际上实现了一步完成气化和离子化。分析物首先由固相或液相变成气相离子，通常情况 下是进行气化，有些粒子在高度真空的环境下很容易气化，但是有些分子要在加热时分解， 如生物大分子蛋白等。MLDI-T0F能够实现在不破坏分子结构的前提下实现由固相到气相 的转变。在MLDI-T0F过程中，分析物首先被大量的基质包裹，并涂在样品盘表面。样品盘 通常是由不诱钢制成，样品的溶液能在样品盘上很快挥发，通常是水、乙腊/水或者丙酬/ 水。基质通常是一种弱酸，并且能够吸收激光，由于基质对一定波长的激光具有强吸收，因 此，无论分析物是否有吸光性基质或分析物在固相层都会发生很强的反应。在经过激光轰 击后，被击中的样品点很快被加热并且获得动能后开始从样品板上脱离下来，运样基质连 同分析物一起气化，由于基质通常是弱酸，一些极性的分析物如蛋白质，能够从基质的簇酸 基团中获得质子，在质量分析器中通过分析物的质荷比的不同进行分离检巧UdMALDI-TOF作 为微生物鉴定的方法关键点在于分辨率。因为细菌全细胞是一个非常复杂的混合体，而且 整个过程没有前期的分离纯化，所WMLDI-T0F所得结果是一个用于细菌鉴定的平均值， 而对于特异蛋白质分析相对有限。 阳〇化]传统的微生物分类包括表型分类、生理生化分类等方式，其归根结底都是微生物 蛋白质差异的不同表现形式。而直接利用蛋白质进行微生物分类更能反映出不同微生物之 间区别的本质，是最有效、最本质的微生物分类和鉴定方法。W高通量的MALDI-T0F为基础 开发的微生物鉴定系统，基于质谱的蛋白质组学技术MLDIBioTyper系统在微生物鉴定和 分类的应用，可实现S方面的工作：①对于一系列已知微生物，可获得MLDI-T0FMS数据 库，即建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；②对于未知微生物，则制备未鉴定 微生物样品，利用MALDI-TOFMS获得质谱数据，再采用提供的软件包，将获得的质谱数据与 已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较，W鉴定具有相同或相似质谱数据的 已知微生物，再建立未知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；③采用提供的软件包工 具，可W利用已建立的已知和未知微生物标准蛋白质组指纹质谱数据库用于临床、环境、工 业未知样品的鉴定。由质谱检测得到的蛋白指纹应用于微生物鉴定。运项技术仅需要极少 量的样品和处理费用，就可W快速鉴定出不明细菌、酵母菌和霉菌，能极好地替代经典的微 生物鉴定和分类技术。
[0006] 但传统的应用于质谱鉴定的革兰氏阴性菌蛋白质的处理方法，如应用于革兰氏阴 性菌的乙醇/甲酸法，将一定量的菌落纯培养巧-lOmg)放入离屯、管中，加入300y1水混 匀，加入900iil乙醇混匀，W最大速度（15000巧m)离屯、2min，除去上清液，重复离屯、，完全 除去乙醇，加入50y1 70%的甲酸，重新悬浮所有菌落，并且剧烈震荡Imin，加入50y1纯 乙腊混匀，最大速度（15000rpm)离屯、2min，转移上清液到一个新的离屯、管中，样品制备完 毕可直接进行鉴定。
[0007] 传统的应用于革兰氏阳性菌蛋白质的提取方法为80%TFA提取法。其主要过程 为将一定量的菌落纯培养物巧-lOmg)放入离屯、管加入50ul80%TFA(S氣乙酸），悬浮震 荡使得菌体混匀，静置数分钟。加入=倍体积（150ul)的去离子水，加入等体积（200ul)的 100%乙腊，最大速度（15000rpm)离屯、2min，转移上清液到一个新的离屯、管中，样品制备完 毕可直接进行鉴定。
[0008] 但是传统的样品处理方法不能有效排除细菌生长过程中产生的几下质物质，胞外 多糖和脂多糖，细菌菌体的培养基等，从而影响蛋白质的分离纯化，从而影响到了鉴定准确 性和灵敏性，而且当样品不确定是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的情况下，不能快速确定 选用处理方法，因此，现有的用于质谱鉴定的革兰氏阴性菌和阳性菌蛋白质的处理方法不 能通用。
【发明内容】
[0009] 本申请提供一种用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法，解决传统的革兰氏 细菌蛋白质质谱鉴定的准确性和灵敏性不高的问题。
[0010] 根据本申请的第一方面，本申请提供一种用于质谱鉴定的革兰氏细菌洗涂的缓冲 溶液，其缓冲溶液配方包括 0.Olmol/L~0.Imol/L化C1，Immol/L~lOmmol/LTris-HCl， 0.Immol/L~2mmol/L邸TA和 0.Olmmol/L~0. 2mmol/LTritonX-100。
[0011] 根据本申请的第二方面，本申请提供一种用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理 方法，包括W下步骤：
[0012] 利用缓冲溶液洗涂菌体：选取菌体并置于容器中，加入缓冲溶液悬浮菌体，离屯、 后去掉上清液，该缓冲溶液配方包括0.Olmol/L~0.Imol/L化C1，Immol/L~lOmmol/L Tris-HCl,0.Immol/L~2mmol/L邸TA和 0.Olmmol/L~0. 2mmol/LTritonX-100 ；
[0013] 细菌蛋白质提取：往缓冲溶液洗涂后的菌体加入细胞裂解液，重新悬浮菌体，第一 次超声处理，离屯、后去掉上清液；后加入蛋白质溶解液，第二次超声处理，离屯、后收集上层 蛋白质溶液。
[0014] 本申请的有益效果是：通过本发明的缓冲溶液洗涂用于质谱鉴定的革兰氏细菌 后，再提取细菌蛋白质作为鉴定细菌样品，提高了质谱鉴定细菌的分辨率和准确性。
[0015] 进一步地，本申请提供的一种用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法，不仅 提高了质谱鉴定细菌的分辨率和准确性，还同时适用于革兰氏阴性菌和阳性菌的样品处理 方法。
【具体实施方式】
[0016] 本发明用于质谱鉴定的革兰氏细菌洗涂的缓冲溶液配方包括：0.01mol/L~ 0.Imol/LNaCl，lmmol/L~lOmmol/LTris-HCl，0.Immol/L~2mmol/LEDTA和O.Olmmol/ L~0. 2mmol/LTritonX-100。Tris-肥1为S(径甲基）氨基甲烧-盐酸缓冲液；邸TA为 乙二胺四乙酸络合剂；TritonX-100为聚乙二醇辛基苯基酸非离子型表面活性剂。
[0017] 该缓冲溶液可应用于本发明的用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法中洗 涂菌体步骤，也可应用于传统的质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质的处理方法。本发明的缓冲 溶液的核屯、组分为化C1、化is-肥1和邸TA，化is-肥1和邸TA的主要作用是维持一定抑 值，并改变菌体周围的