胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒及检测系统的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂 盒及检测系统。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为 起源于腺管上皮的导管腺癌。通常发病后的患者，5年生存率〈1 %，是预后最差的恶性肿瘤 之一。
[0003] 导致胰腺癌预后生存率如此低的重要原因在于胰腺癌早期无任何症状，难以在胰 腺癌发病潜伏期或者初期被检测发现，从而贻误最佳的治疗时间。主要难以被检测发现是 因为在发病初期无任何症状，而且目前所能采用的检测精确度最好的CA19-9、CEA、CA242 胰腺癌检测标记物进行检测时，有一定的阳性率，且不具备高特异性。根据统计数据显示， 采用上述标记物在胰腺癌孕育期检测（癌变之前）敏感性较低，如发病前1年，有68%的敏 感性，发病前两年，敏感性为53%。而采用其他的常规临床技术检测，如B超、CT、MRI、ERCP、 PTCD、血管造影、腹腔镜等检查到发现癌变时已处于癌症中晚期，极大耽误了诊断和治疗。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够准确性和特异性 更好的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，包括CRP单抗、ICAM-I单抗、OPG单抗 和CA19-9单抗，以及用于形成双抗夹心的酶标二抗。
[0007] 在上述双抗夹心的试剂盒的基础上，本发明进一步还提出一种包括上述胰腺癌蛋 白生物标记物的检测试剂盒的检测系统。
[0008] 本发明的检测试剂盒和检测系统，以针对本发明通过"差减法"的方式筛选得到的 CRP、ICAM-U0PG和CA19-9这四种胰腺癌蛋白生物标记物，进行免疫制备特异性CRP单抗、 ICAM-I单抗、OPG单抗和CA19-9单抗为基础，并且结合双抗夹心的酶标二抗，通过抗原-抗 体的特异性结合并联合双抗夹心的二抗从而对上述生物标记蛋白进行检测，具有比较高的 准确性和特异性。
【附图说明】
[0009] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0010] 图1为本发明实施例检测芯片中固相基质上的点样孔的排布示意图；
[0011] 图2为本发明实施例胰腺癌蛋白生物标记物的检测芯片封装之后的整体形状示 意图。
【具体实施方式】
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0013] 本发明提出一种胰腺癌蛋白生物标记物，包括CRP(C反应蛋白）、ICAM-I (细胞间 黏附分子-I)、OPG (骨保护素）和CA19-9 (糖链抗原19-9)。
[0014] 本发明根据对胰腺癌的检测和检查，提出上述生物标记物，相比现有临床分析的 手段和通常用的CA19-9、CEA、CA242胰腺癌检测标记物，本发明的标记物更加准确。本发明 的上述生物标记物组合的发现和提出基于本身生物标记物是反映疾病存在和状态的一种 可测量的指示物，在疾病、应激和康复的过程中，任何的生理变化最终都能在蛋白水平上得 到体现，是疾病研究最直观的手段；并且多个蛋白生物标志物组群与慢性病患者的临床及 预后密切相关，表明同步联合测定多个蛋白因子有助于更全面的了解疾病进程。
[0015] 上述提出的生物标记物组合中的蛋白，属于疾病所特有的调节性蛋白。由于组织 液，如血浆中蛋白种类过千，浓度范围跨度高达10 1°,用最先进性的仪器也只能测到浓度范 围跨度1〇3;为攻克健康背景蛋白对疾病特有的调剂蛋白的干扰。在本发明采用差异分析的 方法筛选到以上标志蛋白，并进行了验证。具体筛选过程如下：
[0016] (1)选取已知身体状况的受试者共210例，其中健康对照55例，胰腺癌初期患者 (未转移）65例，发生转移胰腺癌患者90例。（本研究已被伦理审核机构批准，所有受试者 均签署知情同意书。）
[0017] 分别取受试者血液样本2ml，加入1%肝素，于4度，3500RPM离心15min后将血浆 分装分别根据患病与否分为健康对照血浆样本、胰腺癌初期（未转移）患者血浆样本和发 生转移胰腺癌患者血浆样本；
[0018] (2)然后用健康对照血浆样本作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体；并用该制备 的多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；
[0019] (3)将胰腺癌初期患者样本，发生转移胰腺癌患者样本分别用上述亲和层析柱上 样过柱子，收集流穿液。
[0020] 由于体液如血浆中蛋白种类过千，浓度范围跨度高达10'目前最先进性的仪器也 只能测到浓度范围跨度1〇 3;目前用抗体亲和去除样品中20到100多个高丰度蛋白，尽管提 高了对低丰度蛋白的检出率，当相对于血浆中1000多个蛋白来说，残留的相对高丰度蛋白 对目前癌症所用标志物的ng浓度和癌症发生发展孕育期相关标志物的Pg浓度的分析信号 仍然存在严重的淹没效果。基于以上原因，本发明采用差减法技术，用健康对照的血浆样本 作为抗原免疫家兔，制备抗健康对照血浆蛋白的多克隆抗体，采用这一抗体作为亲和吸附 介质制备层析柱，便能将患者血浆样本中的大量健康相关蛋白特异性吸附去除，从而尽可 能多地获得疾病相关，排除健康相关高丰度蛋白的干扰。
[0021] 低丰度差异表达蛋白在富集之后，由于去除了大量的高丰度蛋白的背景干扰，而 且在量进行了富集之后，便能用SDS-PAGE和质谱的手段分析和检测出来了。
[0022] (4)将上述收集到的流穿液用质谱技术鉴定及定量蛋白
[0023] 前期筛选阶段，健康对照组、胰腺癌初期患者（未转移）、发生转移胰腺癌患者分 别进行质谱鉴定，重复三次，每组蛋白三次重复中共同鉴定到的蛋白分别鉴定到210、320 和378个蛋白。
[0024] 因本发明旨在寻找胰腺癌早期生物标志物，其中仅在胰腺癌初期患者（未转移）、 发生转移胰腺癌患者中均出现，但在健康对照中未出现的蛋白有45个。在健康对照组、胰 腺癌初期患者（未转移）、发生转移胰腺癌患者均出现的蛋白有179个。本试验主要针对仅 在胰腺癌初期患者（未转移）、发生转移胰腺癌患者中共同出现的45个蛋白进行分析。
[0025] 通过文献报道和生物信息学分析（Gene Ontology和KEGG Pathway分析）对在建 康对照中未出现，但在胰腺癌患者血浆中出现的45种进行分析，功能注释。发现CRP (C反 应蛋白），ICAM-I (细胞间黏附分子-I)、OPG (骨保护素）、CA19-9在胰腺癌发生、发展过程 中发挥着非常重要的作用。
[0026] (5) ELISA 法验证
[0027] 利用ELISA确认上述差异蛋白在正常对照和各疾病组血液中的表达量。具体地 说，利用稀释缓冲液将血浆1 :1〇〇稀释，然后利用针对不同蛋白生物标志物的ELISA板测量 不同疾病组血液中生物标志物的含量，每个样本重复测量三次。ELISA技术检测的结果数 据用SPSS 14.0软件处理，以平均值土标准差表示。用ANOVA进行正态分布数据的组间比 较；用受试者工作特性曲线（ROC)分析各种生物标志物预测的准确性、特异性及灵敏性。检 测的结果如下表1，从表1的结果显示，胰腺癌组血浆中CRP (C反应蛋白）、ICAM-I (细胞间 黏附分子-I)、OPG (骨保护素）、CA19-9的表达量显著高于健康对照，且随着患者病情的严 重（蛋白尿增加）而增加。
[0028] 表1 ELISA验证4种胰腺癌早期标志物
[0029]
[0030] 注：ND:No Difference ;*p〈0.0 Olvs.健康对照；
[0031] 进一步利用受试者工作特性曲线（ROC)分析胰腺癌患者和健康对照血液中的四 种生物标志物，结果表明CRP(C反应蛋白），ICAM-I (细胞间黏附分子-I)、0PG(骨保护 素）、CA19-9 曲线下面积（AUC)分别为 0· 892 (ρ〈0· 01)、0· 858 (ρ〈0· 01)、0· 907 (ρ〈0· 01)和 0. 901 (ρ〈0. 01)。敏感性和特异性分析显示，当选取最高"youden"指数时，血液中四种生物 标志物的灵敏度、特异度和浓度截断