一种刀豆球蛋白a的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学发光技术领域，涉及一种刀豆球蛋白A的测定方法。
【背景技术】
[0002] 刀豆球蛋白A(Con A)，又名刀豆凝集素、刀豆素，是一种植物血凝素，具有强力 的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，其促淋巴细胞转化最适浓度为 40-100 μ g/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、马、狗、兔、猪、大鼠、小鼠、豚鼠等动物及人红细胞。 还能选择性激活抑制性T细胞（Ts细胞），对调节机体免疫反应具有重要作用。因此，通过 使用Con A来活化病态（或老年）时的Ts细胞这一途径，可望改观一些自身免疫性疾病，甚 或在移植物排斥反应或恶性肿瘤的防治方面具有广泛的应用前景。近年来刀豆球蛋白A测 定方法主要有：凝集抑制试验法（Carrotta R, Vilasi S, Librizzi F, Martorana V，Bulone D, San Biagio PL Entrapment of Aβ l-40peptide in unstructured aggregates. J Phys Chem B 2012,116(50):14700-12707);表面等离子体共振法（Bellapadrona G, Tesler AB, Grilnstein D, Hossain LH, Kikkeri R, Seeberger PH, Vaskevich A, Rubinstein 1.0 ptimization of localized surface plasmon resonance transducers for studying carbohydrate-protein interactions. Anal Chem. 2012,84(1) :232-240);散射光测定 法（Babu P,Sinha S,Surolia A.Sugar-quantum dot conjugates for a selective and sensitive detection of lectins.Bioconjug Chem. 2007, 18(1) :146-151);等温滴定 量热法(Wang X, Matei E, Gronenborn AM, Ramstrom 0, Yan M. Direct measurement of glyconanoparticles and lectin interactions by isothermal titration calorimetry.Anal Chem. 2012,84(10) :4248-4252.);电化学（Liu BQ，Zhang B, Chen GN, Yang HH, Tang DP.Proximity ligation assay with three-way junction-induced rolling circle amplification for ultrasensitive electronic monitoring of Concanavalin A. Anal Chem. 2014, 86:86, 7773-7781.)等。但是，这些方法的各有其缺点， 本发明利用磁珠为载体，以异硫氰酸荧光素 FITC为标记物，以光诱导化学发光原理，实现 了刀豆球蛋白A的测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种灵敏的测定刀豆球蛋白A的新方法，利用磁珠为载体，以 FITC为标记物，实现刀豆球蛋白A的测定。
[0004] 技术方案
[0005] 本发明是基于刀豆蛋白A识别氨基葡萄糖修饰磁性微球链式杂交反应原理测定 刀豆蛋白A的方法。在目标物刀豆蛋白A存在时，标记有不同DNA链的磁性微球相互靠 近，磁性微球表面修饰的DNA发生杂交反应，然后，再与修饰有异硫氰酸荧光素 FITC的发卡 DNA =FITC-Hl和FITC-H2进行杂交链式反应，利用光二极管诱导化学发光原理，根据化学发 光强度，实现对刀豆蛋白A的测定。其特征为：
[0006] a.将发卡DNA在使用之前孵化，然后，逐步降温至室温；
[0007] b.取羧基化磁珠至小离心管中，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到 Tris-HCl缓冲溶液中；
[0008] c.将N-(3_(二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加 入步骤b中处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇Ih ;
[0009] d.将氨基化葡萄糖水溶液和DNAl加入步骤C所得溶液中，在4°C中条件下，振动 12h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNAl经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两 遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液；
[0010] e.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA2加入步骤C所得溶液中，在4°C中条件下，振动 12 h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA2经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两 遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液；
[0011] f.将GA-MB-DNAl溶液和GA-MB-DNA2溶液混合，然后加入刀豆球蛋白A的样品溶 液，在37°C下振荡反应30min，反应完全后，磁分离，并用磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上 清液；
[0012] g.取含有FITC-Hl和FITC-H2的磷酸缓冲溶液加入到步骤f的溶液中，在37°C振 荡反应lh，然后将磁珠用磷酸缓冲溶液清洗两遍，再将其分散于磷酸缓冲溶液中；
[0013] h.取鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入步骤g所得磁珠溶液，打开光二极管电源，照 射一段时间后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀豆球蛋白A的 测定。
[0014] 测定具体步骤如下：
[0015] (I) GA-MB-DNAl 和 GA-MB-DNA2 探针的制备
[0016] 实验中的发卡DNA在使用之前在95°C下孵化2min，然后，逐步降温至室温。
[0017] a.取10 μ L羧基化磁珠至L 5mL小离心管管中，并用100 μ L pH 8. OTris-HCl缓 冲溶液洗涤两遍，并分散到100 μ L的Tris-HCl缓冲溶液中。
[0018] b.将40mM N-(3-(二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和IOmM N-羟基琥 珀酰亚胺加入上述处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇lh。
[0019] c.将5 μ L· 30 μ M氨基化葡萄糖水溶液和50 μ L· 5 μ M的DNAl加入上述所得溶液 中。在4°C中条件下振动12h。反应完成后，将所得产物GA-MB-DNAl经过磁性分离，并用 100 μ L pH 8. 0的Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到ImL的Tris-HCl缓冲溶液中。
[0020] d.利用上述C类似的方法，合成氨基化葡萄糖和DNA2修饰的磁珠 GA-MB-DNA2。
[0021] (2)刀豆球蛋白A的测定
[0022] a.将 100 μ L GA-MB-DNAl 溶液和 100 μ L GA-MB-DNA2 溶液混合，然后加入 100 μ L 刀豆球蛋白A的样品溶液，在37°C下振荡反应30min。反应完全后，磁分离，并用IOOyL PH6. 8的磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上清液。
[0023] b.取 100 μ L 含有 1.0 X 10 7M FITC-Hl 和 1.0 X 10 7M FITC-H2 的 pH 6. 8 的磷酸 缓冲溶液加入到上述溶液中中，在37°C振荡反应lh，将磁珠用IOOyL pH 6. 8的磷酸缓冲 溶液清洗两遍，然后分散于100 μ L pH 6. 8的磷酸缓冲溶液中。
[0024] (3)化学发光检测