钕离子敏化上转换纳米晶新用途及高分辨多光子显微系统的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种钕离子敏化上转换纳米晶新用途及高分辨多光子显微系统。
【背景技术】
[0002]在现代光学成像技术中，借助探针标记的荧光显微镜，尤其是基于荧光单光子过程的激光扫描共聚焦显微镜，凭借高分辨率(约200纳米)已经在医学、生命科学和材料科学领域得到了广泛的应用。然而，共聚焦显微镜也有不少缺陷，如系统相对复杂，紫外、蓝光激发易损伤生物样品，成像深度十分有限(几十微米)，难以避免生物样品自发荧光的干扰，样品易光漂白等。基于一些生物样品及材料非线性激发下的天然“光学切片”能力，人们提出了双光子扫描显微镜，这种显微系统相对容易搭建，近红外激发光也能减小生物光损伤并能提高成像深度(几百微米，甚至毫米)，在一定程度上解决了共聚焦显微系统存在的问题。然而，近红外(大于800纳米)激发的双光子荧光显微镜分辨率相对不高的分辨率(微米量级)严重限制了其在生物显微成像中的应用。这一低分辨率是由其理论计算公式d= 1.22λ/2ΝΑ(Ν)ν2所制约的，其中λ是激发光波长，NA是显微物镜的数值孔径，N是多光子成像的非线性阶数(双光子成像中N= 2)。理论上，通过减小激发光波长，增大显微物镜数值孔径和多光子非线性阶数都可以提高分辨率，而机械上的显微物镜数值孔径已经很难继续提高，因此，用更短激发波长进行更高阶多光子成像成为提高多光子显微镜分辨率的必然选择。
[0003]然而，多数荧光物质的非线性多光子(双光子、三光子、四光子)激发截面非常小，使用超高峰值功率的飞秒脉冲激光器可以获得更强的多光子荧光，但高昂的光源费用(?$200，000)限制了它的广泛推广，同时使用短波长激发下的三光子、四光子荧光波长又通常落在紫外波段，对检测光路与探测器要求高，这都不利于进行短波长激发下的多光子高分辨率显微成像。虽然已有提出稳态激光栗浦的低成本双光子显微镜，但是近红外波长(大于800纳米)激发的低阶双光子成像时分辨率仍不高。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的就是克服现有的研究方向偏见，提供一种钕离子敏化的上转换纳米材料在多光子显微成像中的用途，所述钕离子敏化的上转换纳米材料由中心波长< 800nm的稳态连续激光激发，在得到的多光子荧光光谱中，多光子发射峰均在可见光范围内。
[0005]相较于传统的镱离子敏化的上转换纳米晶，钕离子敏化的上转换纳米材料有很好的光稳定性，从光谱中可知，无论是激发光谱还是多光子(三光子、四光子)发射光谱，都可以选取在可见光范围内的短波长进行成像和探测。更重要的是这种材料相比传统上转换材料具有更大的多光子吸收截面，具有明显更大的多光子激发饱和功率，能够产生更强的多光子荧光，因此可以使用廉价的稳态激光器，普通的光电探测器来进行多光子显微成像，不仅可以提高现有的多光子显微成像分辨率，同时大幅降低系统成本，解决共聚焦显微镜、双光子焚光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。
[0006]根据上述用途搭建一多光子显微成像系统，该系统包括中心波长< SOOnm的稳态连续二极管激光器、显微镜光学系统和载物台，所述显微镜光学系统包括扩束透镜组、扫描振镜、短通二向色镜、荧光滤光片、光电探测器和物镜，样品放置在载物台上，稳态连续二极管激光器产生的短波长连续激光耦合进入所述显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜组、扫描振镜和短通二向色镜，其中短通二向色镜与该激光束成45°角放置；在垂直于该激光束且穿过该短通二向色镜的光轴方向上，在该短通二向色镜上方同轴地依次放置有荧光滤光片和光电探测器，在该短通二向色镜下方放置有物镜，钕离子敏化的上转换纳米材料样品放置在载物台上物镜的焦点处；短通二向色镜使激发光反射、钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光透射。
[0007]优选的，所述稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为720?740nm，所述短通二向色镜用于反射波长大于670nm的激发光，透射波长小于670nm的多光子荧光。
[0008]优选的，所述稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm时，钕离子敏化的上转换纳米材料产生的多光子荧光光谱中，465-480nm波段为该样品的三光子发光峰，450-460nm波段为该样品的四光子发光峰，645_680nm波段为该样品的双光子发光峰。
[0009]更进一步的，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的双光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为lmW，选取645_680nm波段荧光进行探测。
[0010]更进一步的，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的三光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为100uW，选取465_480nm波段荧光进彳T探测。
[0011]更进一步的，所述多光子显微成像系统用于进行单颗粒的四光子成像时，稳态连续二极管激光器发射的激发光波长为730nm，焦面处功率为100uW，选取450_460nm波段荧光进行探测。
[0012]本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果:
[0013]1、本发明发现了由中心波长< SOOnm的稳态连续激光激发的钕离子敏化的上转换纳米材料在多光子显微成像中的用途，通过分析其光频谱可知，无论是激发光谱还是多光子(三光子、四光子)发射光谱，都可以选取在可见光范围内的短波长进行成像和探测。同时，该材料具有更大的多光子吸收截面和多光子饱和激发功率，更易于进行高阶多光子成像，并且不仅限于双光子成像，考虑到生物成像时激发功率不宜过大，这种高效率的高阶多光子激发降低了高分辨活体生物实验对于探测器的要求，因此本发明的高分辨显微系统更易实现。
[0014]2、本发明可以米用二极管激光器作为多光子激发光源，相比于传统的多光子焚光显微镜采用的超快脉冲激光器，价格十分低廉，易于推广。
[0015]3、本发明是使用短波长搭建的多光子显微成像系统，因此相比于传统的SOOnm以上波段也要廉价，易于实验室采购，成本低。
[0016]4、本发明搭建的多光子显微成像系统提高了现有的多光子显微成像分辨率，同时大幅降低系统成本，解决了共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。
【附图说明】
[0017]图1为本发明的基本结构示意图。
[0018]图2为本发明的一个实例的结构示意图。
[0019]图3为本实施例探测到的钕离子敏化上转换纳米材料的激发光光谱。
[0020]图4为本实施例探测到的钕离子敏化上转换纳米材料的多光子发光光谱。
[0021]图5为本实施例中获得的钕离子敏化上转换纳米材料的多光子激发饱和功率。
[0022]图6(a)为本实施例获得的钕离子敏化上转换纳米材料的χ-y平面上的高分辨率双光子成像。
[0023]图6(b)为图6(a)的强度点扩散函数高斯分布曲线图。
[0024]图7(a)为本实施例获得的钕离子敏化上转换纳米材料的χ-y平面上的高分辨率三光子成像。
[0025]图7(b)为图7(a)的强度点扩散函数高斯分布曲线图。
[0026]图8(a)为本实施例获得的钕离子敏化上转换纳米材料的x-y平面上的高分辨率四光子成像。
[0027]图8(b)为图8(a)的强度点扩散函数高斯分布曲线图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029]实施例1
[0030]本发明多光子显微成像系统的基本结构如图1所示，其中I为二极管激光器，2为扩束透镜组，3为扫描振镜，4为短通二向色镜，5为焚光滤光片，6为光电探测器，7为物镜，8为样品，9为载物台。稳态连续激光器中心波长< 800nm，显微镜光学系统包括扩束透镜组
2、扫描振镜3、短通二向色镜4、焚光滤光片5、光电探测器6和物镜7，样品8放置在载物台9上。工作时二极管激光器I产生的短波长连续激光经光纤转换为空间光后进入所述显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜组2、扫描振镜3和短通二向色镜4，其中短通二向色镜4与该激光束成45°角放置；在垂直于该激光束且穿过该短通二向色镜4的光轴方向上，在该短通二向色镜4上方同轴地依次放置有荧光滤光片5和光电探测器6，在该短