一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及电化学检测技领域术，具体涉及一种用于检测溶菌酶的电化学生物传 感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶是一种由多形核白细胞分泌的抗菌蛋白质，通常在人体中，溶菌酶具有生 理和药物上的功能，例如抗炎、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等。溶菌酶在人体液中的浓度在 临床上可以做为许多疾病诊断的标志，例如口咽部念珠菌感染的病人唾液中的溶菌酶的浓 度会升高；肾病患者的尿液中会出现溶菌酶；血液、脑脊髓液中溶菌酶的浓度是白血病和 中枢神经肿瘤疾病的重要辅助诊断依据，因此对于溶菌酶的检测在临床诊断学上具有重要 意义。
[0003] 通常对于溶菌酶的检测必须先对溶菌酶进行分离，常见的方法有凝胶电泳法、高 效液相色谱法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法等，这些方法虽然有高的灵敏度，但是具有操 作复杂，成本高等诸多缺点。人体液中溶菌酶的浓度较低通常只有l〇_ 7mol ? L'因此采用 信号放大策略提高检测限对于溶菌酶的测定是非常必要的。
[0004] 基于核酸适体制备的和具有信号放大功能的电化学生物传感器，在对实际样品检 测时不仅无需对溶菌酶进行测定前的分离，而且还具有较低的检测限，较高的灵敏度和较 好的选择性，同时电化学的检测方法使其具有成本低，操作简便、省时等优点，因此，制备一 种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器为溶菌酶的检测提供了一个新的理想选择。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感 器，利用该电化学生物传感器对溶菌酶进行检测，具有选择性好、灵敏度高等优点。
[0006] 本发明的第二目的是提供该电化学生物传感器的制备方法。
[0007] 本发明的第三目的是提供该电化学生物传感器在检测溶菌酶中的应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)设计一条报告探针DNA链S1，该DNA链可以与溶菌酶适体链S2互补配对并且 自身有16个碱基长度的互补配对序列，能够在适体链脱离后形成颈环结构；S1链的3'端 修饰有二茂铁标记物，该标记物可以产生电化学信号；S1链的5'端硫醇化，使得S1通过 金-硫键修饰到金电极表面；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5'-SH-C6-GTGCAGAGCTAAG TAACTCTGCAC-Fc-3'，如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示；适体 S2 的 DNA 链序列为：5'-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GIT ACT TAG-3'，如序列表中 SEQ ID NO. 2 所示；
[0011] (2)将金电极打磨抛光成镜面，再经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金电 极；
[0012] (3)报告探针S1在含有三（2-羧乙基）膦的缓冲液中打开二硫键，后将溶菌酶适 体S2加入与S1形成双链DNA ;
[0013] (4)将步骤（2)处理好的金电极浸在步骤（3)得到双链DNA溶液中，将双链DNA修 饰到金电极表面，得电化学生物传感器。
[0014] 步骤（2)中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20~60s。
[0015] 步骤（2)中，干燥为氮气吹干。
[0016] 步骤（3)中，所述缓冲液为含有90 ~110mM Tris-HCl，90 ~110mM NaCl，9 ~llmM 三（2-羧乙基）膦的混合液，其pH为7. 2~7. 6。
[0017] 步骤（3)中S1的浓度为1~2uM，S2的浓度为1~2uM。
[0018] 步骤（3)中，双链DNA形成条件为：混合液90°C加热4~6分钟，37°C反应2~3 小时。
[0019] 步骤（4)中，电极浸入双链DNA溶液的时间为20~24小时。
[0020] 本发明还提供了一种上述传感器在检测溶菌酶中的应用，检测步骤为：
[0021] (1)将上述传感器在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与甘汞参比电极和铂 丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的峰电流，二茂铁的峰电流为 I〇(Fc);
[0022] (2)将该电化学生物传感器与不同浓度的溶菌酶进行识别后用SWV在三氯化六氨 合钌检测液中检测，将得到的三氯化六氨合钌的峰电流与步骤（1)得到的差取绝 对值得：I A -^-RuHex I I -^-RuHex ^0 (EuHex) ，同样方法处理将得到I A IFc | ;以 | A IRuHex | +1 A IFc | 对溶菌酶浓度做线性回归方程，得工作曲线；
[0023] (3)在对实际样品进行检测时，采用同样方法对待测样品中的溶菌酶进行SWV检 测，将得到两个峰电流分别与对应1〇做差、取绝对值、加和后代入线性回归方程即得样品中 溶菌酶的浓度。
[0024] 步骤（1)中，三氯化六氨合钌检测液为 100mM Tris-HCl、140mM NaCl、5mM MgCl2、 10 y M RuHex三氯化六氨合钌的混合液，其pH为7. 4。
[0025] 步骤（1)中，浸泡时间为5~6分钟。
[0026] 本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
[0027] (1)本发明制备的方法简单，易操控，反应条件温和，与凝胶电泳法、高效液相色谱 法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法等方法相比较，电化学生物传感器的方式具有样品无需前 处理，易操控，反应条件简单、温和等优点。
[0028] (2)本发明首次将双电化学信号放大的策略结合免标记策略应用到溶菌酶的检测 中来，在实现高灵敏度地对溶菌酶进行检测（检测限达到2. 3X1(T12M)的同时还具有操作 简便，成本低，检测快速高效等优点。
[0029] (3)本发明利用溶菌酶适体与溶菌酶的特异性结合，经多次筛选获得的核酸适体 与靶标分子的亲和力强，解离常数（Kd)经常在nM和pM之间，具有好的选择性和灵敏度，核 酸适体与靶标分子有较大的接触面积，从而能分辨出靶标分子结构上官能团细微的变化， 因此适体具有高度识别的能力，能够直接对实际样品中的溶菌酶进行准确测定。
[0030] (4)本申请中，溶菌酶在不同的缓冲液中清洗，当缓冲液为10mM Tris-HCl，其作用 是，用其冲洗电极可以将未与金电极结合的报告探针链和脱离下来的溶菌酶、溶菌酶适体 冲净；在含有lOOmM Tris-HCl，140mM NaCl，5mM MgCl2的缓冲液中浸泡是有助于DNA颈环 结构的形成；而包含 lOOmM Tris-HCl，140mM NaCl，5mM MgCl2，10yM RuHex 的缓冲液的作 用是使得DNA吸附RuHex，产生RuHex信号的变化。
【附图说明】
[0031] 图1是本申请的原理图；
[0032] 图2是本申请检测溶菌酶的线性关系图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0034] 实验中所使用的仪器及试剂为：（1)仪器：CHI650电化学工作站（上海辰华仪器 有限公司）；采用饱和甘汞电极（SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极；（2)试剂：溶菌酶适 体与报告探针（上海生工生物工程股份有限公司），其他试剂均为分析纯，实验用水为二次 蒸馏水。
[0035] 1、溶液配制
[0036] (1)100mM Tris-HCl，100mM NaCl，ImM MgCl2, pH 为 7. 4 :
[0037] 称取 L 21144g tris、0. 5844g NaCl、0. 02033g ]\%(：12于 150ml 烧杯中溶解，在 25°C 下，用0.2M的盐酸溶液调节pH为7. 4,定容100ml。
[0038] (2)100mM Tris-HCl，140mM NaCl，5mM MgCl2, pH 为 7. 4 :
[0039] 称取 1.21144g tris、0.8182g NaCl、0. 1015g ]\%(：12于15〇1111 烧杯中溶解，在 25°C 下，用0.2M的盐酸溶液调节pH为7. 4,定容100ml。
[0040] (3)100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 为 7.4 :
[0041] 称取 1.21144g tris、0. 5844g NaCl 于 150ml 烧杯中溶解，在 25°C 下，用 0. 2M 的盐 酸溶液调节pH为7. 4,定容100ml。
[0042] (4) 10mM Tris-HCl，pH 为 7. 4 :
[0043] 称取0. 1211g tris，于150ml烧杯中溶解，在25°C下，用0. 2M的盐酸溶液调节pH =7. 4,定容 100ml。
[0044] (5)溶菌酶：超纯水配置 100uM 母液，用 lOOmM Tris-HCl，lOOmM NaCl，ImM MgCl2 的缓冲溶液稀释母液配制成〇. 01nM、0. lnM、0. 5nM、lnM、5nM、10nM、50nM、100nM浓度梯度的 溶菌酶溶液。
[0045] 实施例1 :
[0046] 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步 骤：
[0047] (1)设计一条报告探针DNA链S1，该DNA链可以与溶菌酶适体链S2互补配对并且 自身有16个碱基长度的互补配对序列，能够在适体链脱离后形成颈环结构；S1链的3'端 修饰有二茂铁标记物，该标记物可以产生电化学信号；S1链的5'端硫醇化，使得S1通过 金-硫键修饰到金电极表面；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5'-SH-C6-GTGCAGAGCTAAG TAACTCTGCAC-Fc-3'，如序列表中 SEQ ID