一种镉螯合型免疫复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及属于医学领域，具体设及簡馨合型免疫复合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 免疫复合物（Immunecomplexes, 1C)是抗原抗体结合的产物，根据全国科学技术 名词审定委员会的定义，是指抗体与可溶性抗原结合而形成的复合物。它分为两类，一种是 组织中固定的免疫复合物，而另一种则是游离于血液中的免疫复合物，成为循环免疫复合 物（circulatingimmunecomplexes,CIC)。免疫复合物在清除和破坏各种抗原中起着不 可缺少的作用，机体免疫反应的结果就是不断产生免疫复合物。当机体内抗原（或抗体） 数量略多于抗体（或抗原）时，就会形成中等分子大小的免疫复合物，它既不易被吞瞻细胞 吞瞻，又不能通过肾小球滤孔排出，可较长时间游离于血液和其他体液中。当血管壁通透性 增加时，此类1C可随血液沉积在某些部位的毛细血管壁或嵌合在肾小球基底膜上，激活补 体导致免疫复合物沉积。该些沉积或镶嵌于血管壁或组织的免疫复合物，乃造成血管基膜 炎症和组织损伤的始动因素。免疫复合物可通过W下几方面造成组织损伤；1)激活补体： 沉积的1C通过激活补体，产生过敏毒素和具有趋化效应的活性片段，趋化至局部的肥大细 胞、嗜碱性粒细胞释放活性介质致局部血管通透性增高，引起渗出和局部水肿；2)吸引白 细胞浸润和集聚；中性粒细胞在吞瞻1C时释放毒性氧化物和溶酶体酶，损伤邻近组织；3) 活化血小板；1C可通过活化血小板释放血管活性胺类物质，导致血管扩张、通透性增加，加 剧局部渗出和水肿，并激活凝血机制，形成微血栓，引起局部缺血、出血和组织坏死。
[0003] 多种疾病的发生都与免疫复合物的沉积息息相关，如系统性红斑狼疮、类风湿性 关节炎、肾病综合征、冷球蛋白血症、脉管炎、细菌、病毒和寄生虫感染、过敏反应、自身免疫 疾病、皮肤病等。早在上世纪90年代，就有学者发现，在正常机体中，免疫复合物被不断降 解，因而一般检测不到免疫复合物或只呈现低浓度，而在上述一系列疾病中，血清中的免疫 复合物即CIC含量显著升高。虽然CIC检测不具有疾病特异性，但其检测能提供关于免疫 病理、疾病的发展及预后方面的信息。在某些微生物感染、自身免疫中，检测循环免疫复合 物可用作疾病活动性、评价机体的机能和检测疗效的指标。而近些年来，学者们致力于研究 特异性的免疫复合物，研究各种特异性免疫复合物与疾病致病、疾病发展、疾病诊断等各方 面的关系，而该些研究将促使我们对疾病有更深一步了解。
[0004] 簡是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括电锻、 制造工业颜料、塑料稳定剂、镶铭电池等，与人们生活息息相关。对于普通人群，主要是通过 吸入簡污染的空气，及食用含簡污水灌概农田生产的农作物（如含簡大米）等方式摄入簡。 当然，吸烟也是慢性簡吸入的另一重要来源。随着经济的飞速发展，簡污染对于人类的影响 越来越大。
[0005] 2004年美国学者A.Ramanaviciene等发现血清中循环免疫复合物含量与地方环 境污染有关，发现随着地区污染严重程度的增加，当地牛血清中的CIC含量显著增加，差异 具有统计学意义，因而可W作为评价地区污染的指标。但环境污染究竟是如何刺激机体内 cic含量显著升高，是一种还是多种污染物共同作用导致其升高，CIC的升高是否因此会导 致机体损伤，增加机体对于疾病的易感性，该些都有待研究。众所周知，循环免疫复合物是 一种特殊意义的蛋白质，而簡可作用于全身多个系统的蛋白质，簡是否可W作用于循环免 疫复合物，而使循环免疫复合物含量改变、活性改变、功能改变，该些尚缺乏相关研究。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种簡馨合型免疫复合物，该 簡馨合型免疫复合物是一种相对特异性的免疫复合物，用于检测地区人群血清中是否簡馨 合型免疫复合物及含量，间接反映该个地区簡污染程度。
[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[000引一种簡馨合型免疫复合物，该簡馨合型免疫复合物为W下复合物中的一种：
[0009] 簡结合于免疫复合物形成的复合物，或
[0010] 簡结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或
[0011] 簡结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。
[0012] 具体的，所述载体蛋白或免疫复合物至少含有锋指结构、琉基、半脱氨酸残基中一 种结构，簡通过锋指结构、琉基、半脱氨酸残基中至少一种与载体蛋白或免疫复合物结合。
[0013] 具体的，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病 毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。
[0014] 进一步的，簡通过馨合剂与载体蛋白结合后再与能和载体蛋白特异性结合的抗体 务主厶 台口口 〇
[0015] 进一步的，所述馨合剂为口CBE、邸TA、多磯酸盐、氨基駿酸、1，3-二酬、哲基駿酸 中的一种。
[0016] 本发明还提供了一种制备簡馨合型免疫复合物的方法，通过该W下方法获得簡馨 合型免疫复合物：
[0017]A)合成簡馨合型免疫复合物的步骤；先将馨合剂与载体蛋白结合，再与簡离子络 合；
[0018]B)提纯簡馨合型免疫复合物的步骤；采用免疫亲和层析去除步骤A)合成的簡馨 合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、特异性抗体及CcT。
[0019] 具体地，所述簡馨合型免疫复合物的制备方法中，
[0020] 所述步骤A)具体步骤如下：
[0021] (1)配制馨合剂；将馨合剂溶于溶剂中，配制成馨合剂溶液；
[0022] (2)配制载体蛋白溶液；将载体蛋白加入到棚酸盐溶液中；
[0023] (3)揽拌过夜；将步骤（1)馨合剂溶液加入到步骤（2)的载体蛋白溶液中，揽拌后 于摇床中过夜，得到混合液；
[0024] (4)透析袋预处理：在透析袋中加入邸TA-Na肥〇3溶液煮沸，弃废液后用d地2〇冲 洗；重复该步骤1-3次；
[0025] (5)透析；将步骤（3)的混合液装入经步骤（4)处理后的透析袋中，用d地2〇透析， 换水2-3次，透析过夜之后，收集液体；
[0026] 做簡离子馨合；在上述步骤妨中的液体中加入肥1溶液调整抑至7. 0,缓慢加 入CdCl2溶液，边滴加边震荡，之后于摇床中过夜，然后重复步骤（5) -次，收集液体，得到 簡馨合型抗原；
[0027] (7)在上述簡馨合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体反应后得到簡馨 合型免疫复合物；
[002引所述步骤B)具体步骤如下：
[0029] (a)将上述A)步骤合成的簡馨合型免疫复合物复溶于生理盐水中，得到复溶液；
[0030] 化）层析柱预处理：使用样品缓冲稀释液冲洗管路，在层析柱中装入含有能与免 疫复合物特异性结合的物质的填料，装柱后继续用样品缓冲稀释液平衡柱子；
[0031] (C)上样；待柱子平衡后，用样品缓冲液稀释上述复溶液，然后上柱，簡馨合型免 疫复合物吸附在填料上，未反应的载体蛋白、抗体、Cd"随缓冲液流出；
[0032] (d)洗脱；使用样品缓冲稀释液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.05-0.Imol/L 的磯酸盐溶液进行洗脱，簡馨合型免疫复合物随着洗脱液洗脱出来；
[0033] (e)收集；收集洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0034] (f)收集到的洗脱液装入透析袋用d地2〇透析除盐，换水2-4次后，多次透析过夜， 收集样本；
[0035] (g)层析柱预处理：采用新的层析柱，用样品缓冲稀释液冲洗管路，在该层析柱中 装入含有能与Cd特异性结合的物质的填料，装柱后再用样品缓冲稀释液平衡柱子；
[0036] 化）上样；待步骤（g)的柱子平衡后，用样品缓冲液稀释上述步骤（f)的样本，然 后将稀释后的样本上柱，簡馨合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的抗原抗体复合物会 随缓冲液流出；
[0037] (i)洗脱；步骤似之后用样品缓冲稀释液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用 0. 5-1.Omol/L的磯酸盐溶液进行洗脱，此时簡馨合型免疫复合物随着洗脱液洗脱出来； [003引U)收集；收集步骤a)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0039] 化）对步骤（j)收集到的洗脱液装入透析袋用d地2〇透析除盐，换水S次后，多次 透析过夜，收集样本，即得到纯化的簡馨合型免疫复合物。
[0040] 本发明还提供了上述簡馨合型免疫复合物在制备检测馨合簡免疫复合物的酶联 免疫试剂盒中的应用。
[0041] 本发明还提供了一种检测馨合簡免疫复合物的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括如 权利要求1所述的簡馨合型免疫复合物的标准品。
[0042] 进一步的，上述试剂盒还包括至少一种W下试剂；W捕获免疫复合物的蛋白作为 包被液、W捕获金属Cd"的抗体作为二抗、酶标抗体。
[0043] 一种检测簡馨合型免疫复合物的方法，W已知含量的簡馨合型免疫复合物作为标 准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、 酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯免疫复合物与原子吸收光谱结合法、提纯 免疫复合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合 等离子体质谱结合法。
[0044] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0045] 1.首次合成了簡馨合型免疫复合物，并证实了在机体内簡可存在于免疫系统，并 证明了簡馨合型免疫复合物的存在；
[0046] 2.本发明实现了免疫复合物的特异性识别，并实现了簡馨合型免疫复合物的定量 检测，提供从免疫角度检测机体内的簡含量水平的方法，并为工业地区的簡污染水平提供 间接指标。
[0047] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0048] 图1为本发明实施例1所述簡馨合环免疫复合物电泳图；
[0049]图2为本发明实施例所述的簡馨合环免疫复合物巧光分析图
【具体实施方式】
[0化0] -种簡馨合型免疫复合物，该簡馨合型免疫复合物为W下复合物中的一种：
[0051] 簡结合于免疫复合物形成的复合物，或
[0052] 簡结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或
[0053] 簡结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。
[0化4] 具体的，所述载体蛋白或免疫复合物至少含有锋指结构、琉基、半脱氨酸残基中一 种结构，簡通过锋指结构、琉基、半脱氨酸残基中至少一种与载体蛋白或免疫复合物结合。
[0055] 具体的，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病 毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。
[0056] 进一步的，簡通过馨合剂与载体蛋白结合后再与能和载体蛋白特异性结合的抗体 务主厶 台口口 〇
[0化7] 进一步的，所述馨合剂为口CBE、邸TA、多磯酸盐、氨基駿酸、1，3-二酬、哲基駿酸 中的一种。