一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法,尤其涉及一 种使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的 方法。
【背景技术】
[0002] 神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一,它能维持交感神经和感 觉神经细胞的生存,具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能,对中枢及周围神经元 的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用,对保护神经系统的正 常功能具有重要作用。
[0003]目前,国内生产、销售的各种NGF制剂均为冻干粉针剂型,并使用人血清白蛋白作 为稳定剂,而一些携带来源于供血者血液中不易检测的病毒的人血清白蛋白会给生产的制 剂带来污染,在患者用药的同时导致严重的传染性疾病,鉴于此种问题时有发生,已经开发 出使用氨基酸的混合物作为稳定剂,替代人血清白蛋白,有效避免了人血清白蛋白导致的 血液制品污染,并且降低了生产成本。
[0004] 同时,含有使用人血清白蛋白作为稳定剂的NGF制剂,由于制剂中NGF的含量较 低,而人血清白蛋白与NGF均为蛋白质,且在制剂中的浓度明显高于NGF,因而严重影响了 NGF的准确定量。目前常用于生物制品中蛋白质含量测定的方法如Lowry法、紫外吸收法、 Bradford法、酶联免疫吸附(ELISA)、SDS-PAGE法等均不能有效排除这种干扰,而且无法准 确定量。公开号为CN1566941的专利中公开了一种测定制剂中神经生长因子含量的方法, 该方法在检定时,虽然能够较准确地测定制剂中NGF的含量,但是该方法仍难以使NGF与白 蛋白达到完全分离,也难以准确测定出有效成分NGF的含量,不利于产品质量控制。
[0005] 有鉴于此,需要一种能够有效测定制剂中NGF含量的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种可以测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方 法。
[0007] 除非特别指明,本发明中的"去白蛋白神经生长因子制剂"指"不含人血白蛋白的 神经生长因子制剂,如含有稳定剂为氨基酸的神经生长因子制剂。
[0008] 本发明的神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法为使用超高效液相 色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子含量,所述凝胶色谱法的色谱条件为:
[0009] 凝胶色谱柱为分子量检测范围为1000~80000道尔顿、孔径为125-200埃的UPLC 分子筛色谱柱;
[0010] 流动相为pH值6. 5~7. 2,浓度为0. 1~0. 5M的磷酸盐缓冲液,所述流动相中有 机相的含量为5~20体积%,所述有机相为乙腈、甲醇或异丙醇,优选为乙腈;所述流动相 中有机相的含量优选为15体积% ;
[0011] 柱温为 30 ~50°C;
[0012] 所述流动相的流速为0? 1~0? 5ml/min,所述流速优选为0? 1~0? 3ml/min ;
[0013] 该检测器采用钛流通池,检测波长为205~280nm ;优选地,所述检测波长为 205~220nm ;所述检测器优选为紫外检测器。
[0014] 在本发明的较佳实施方案中,所述流速为0. 2ml/min。
[0015] 在本发明的较佳实施方案中,所述凝胶色谱柱选自Waters UPLC SEC,1.7 iim, 4. 6 X 150mm,该色谱柱的分子量范围在1000~80000道尔顿、孔径为125埃。
[0016] 在本发明的较佳实施方案中,流动相pH值为7.0,柱温为40°C。
[0017] 在本发明的较佳实施方案中,检测波长为214nm。
[0018] 在本发明的较佳实施方案中,凝胶色谱法的进样量为2 ill。
[0019] 在本发明的较佳实施方案中,所述制剂包括含人血白蛋白的神经生长因子制剂和 去白蛋白神经生长因子制剂。
[0020] 在本发明的较佳实施方案中,所述神经生长因子的含量通过外标法测定。
[0021] 本发明相比较之前的测定方法,能够将NGF与辅料完全分开;并且检测时间缩短 了 4倍,溶剂使用量减小了 3倍,样品量减小了 10倍,适合于获得量较少的样品测定;同 时,采用机器自动调整配比,进行pH值的调节,自动化程度高,减少了人为误差;最重要的 是,有效排除了制剂中包含人血白蛋白在内的辅料的干扰,经过方法学验证,回收率均在 95 %~105 %之间,回收率合格,而且重复性良好,可以对制剂中的NGF进行准确定量。
【附图说明】
[0022] 图1表示流动相专属性图谱,
[0023] 图2表示NGF对照专属性图谱,
[0024] 图3表示含人血白蛋白NGF制剂空白辅料专属性图谱,
[0025] 图4表示含人血白蛋白NGF制剂专属性图谱,
[0026] 图5表示去白蛋白NGF制剂样品空白辅料专属性图谱,
[0027] 图6表示去白蛋白NGF制剂样品专属性图谱,
[0028] 图7表示流速为0. lml/min的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱,
[0029] 图8表不流速为0. lml/min时测定的去白蛋白神经生长因子制剂样品图谱,
[0030] 图9表示流速为0. 5ml/min时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱,
[0031] 图10表示流速为0. 5ml/min时测定的去白蛋白NGF制剂样品图谱,
[0032] 图11表示采用普通流通池测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱,
[0033] 图12表示采用普通流通池测定的去白蛋白NGF制剂样品图谱。
[0034] 图13表示甲醇:0? 1M PBS = 20:80, pH = 6. 5为流动相、柱温为50°C时测定的含 人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
[0035] 图14表示异丙醇:0? 5M PBS = 5:95,pH = 7. 2为流动相、柱温为30°C时测定的含 人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
[0036] 图15表示检测波长为205nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
[0037] 图16表示检测波长为214nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
[0038] 图17表示检测波长为220nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
[0039] 图18表示检测波长为280nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
【具体实施方式】
[0040] 由于现有方法均不能有效排除这种干扰,难以将NGF与人血白蛋白达到完全分 离,也难以准确测定出有效成分NGF的含量,不利于产品质量控制。因此,本发明的发明人 开发了 UPLC凝胶色谱法,并惊奇地发现通过使用钛流通池,能够将NGF和辅料完全分开, 有效排除人血白蛋白的干扰,从而达到了准确测定NGF含量的目的;并且现有方法中每个 样品的走样时间需要约20分钟,而UPLC-SEC可以在5分钟内实现完全分离,大大节约了时 间,节省了溶剂使用量。
[0041] 本发明的神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法为使用超高效液相 色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子,色谱条件为 :
[0042] (1)凝胶色谱柱:分子量检测范围为1000~80000道尔顿、孔径为125-200埃的 UPLC分子筛色谱柱;
[0043] (2)流动相:pH值为6. 5~7. 2,浓度为0? 1~0? 5M的磷酸盐缓冲液,含5~20体 积%有机相,所述有机相为乙腈、甲醇或异丙醇,含有该有机相的流动相能够保证峰形好, 优选地当使用乙腈时,还能保证压力低。
[0044] (3)柱温:40°C;流速:0? 1~0? 5ml/min;检测波长:205~280nm;检测器:采用钛 流通池;流速优选为0. 1~0. 3ml/min,更优选地为0. 2ml/min,该流速下能够使NGF和辅料 完全分离,从而更准确地测定制剂中NGF的含量。检测波长优选为205~220nm,更优选地 214nm,该波长经方法耐用性验证,在检测波长214 ± 5nm范围内进行NGF含量检测时,对NGF 含量测定值无影响。
[0045] 所述凝胶色谱柱选自Waters UPLC SEC,1. 7 y m,4.6 X 150mm,该色谱柱的分子量 范围在1000~80000道尔顿、孔径为125埃。
[0046] 通过实验,获得本发明的较佳实施方案,其中流动相pH值为7. 0,流速为0. 2ml/ min,检测波长为214nm,进样量为1。
[0047] 使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法对制剂中NGF含量进行测定,其基本原理 是通过流经色谱柱的各种物质的分子量差异将其分离,分子量越大,保留时间越短。由于每 种物质在一定条件下具有特定的保留时间,因此可通过色谱图上的保留时间获知目的峰的 位置和相关参数,并通过峰面积