一种用于sam检测的酶电极传感器的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种酶电极传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种用于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)检测的酶电极传感器的制备方法，用于检测药品、生物样品中的S-腺苷甲硫氨酸技术。
【背景技术】
[0002]S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM含有活性甲基，细胞内几乎所有用于甲基化修饰的甲基都来自SAM甲硫高能键。由于甲基化反应的广泛性，可以说，SAM是细胞内参加反应的重要性仅次于ATP的一种辅酶，细胞内SAM浓度的微小改变，便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响。SAM在细菌体内主要是由SAM合成酶(MetK)通过甲硫氨酸(Met)和ATP来合成。当万.的SAM合成酶水平下降，造成细胞内甲基供体SAM缺乏时，细胞就不会正常分裂。如果将来自T3噬菌体的AdoMet水解酶基因导入E.菌体细胞，使胞内SAM水平下降时，大肠埃希氏菌也形成了不分裂的长丝状菌体。进一步研宄表明，丝状菌体中，引发疋细胞分裂的Z环复合体装配可以正常起始，但不会完成，而当亮氨酸调节的SAM合成酶水平恢复正常，细胞内甲基供体SAM不再缺乏时，细胞分裂也随即恢复正常。很明显，细菌细胞的生长分裂与胞内SAM浓度是密切相关的。
[0003]通用甲基供体SAM受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸(SAH)，SAH被发现对胞内蛋白质和核酸的甲基化过程具有普遍的反馈抑制作用，是转甲基化反应的有效竞争性抑制剂。在哺乳动物细胞内，SAH通过SAH水解酶(SAHH)催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸，而在大多数病原微生物的细胞内，SAH的代谢则采用完全不同的方式一一通过S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH进一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和4，5 二羟_2，3-乙酰基丙酮(DH))，高半胱氨酸最后通过几种甲硫氨酸合成酶(MetH、MetE)重新生成SAM的前体一一甲硫氨酸，或者经过多步酶催化生成半胱氨酸。
[0004]酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研宄起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。
[0005]目前，已报道的测定SAM的方法有高效液相色谱法(HPLC)，该方法存在色谱柱容易污染，分析价格昂贵的缺陷，分光光度法，谷劲松等研宄S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲级转移酶活性的检测方法(谷劲松等，一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲级转移酶活性的检测方法，高等学校化学学报，2012，33(3):521~525)，该方法是依赖甲基转移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用将SAM分解为高半胱氨酸，再对高半胱氨酸显色反应，操作比较繁琐，准确度也不理想。由于样品的基质比较复杂，给检测带来了困难。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研宄人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全、生物样品中的SAM含量准确定量测定十分必要，对于SAM生产和药理研宄也具有十分重要的意义。
[0006]生物酶电极传感器是当前开发具有专一性、稳定性、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点，广泛用于医药临床、食品、环境及生物样品检测领域，而将甲基转移酶固定在电极上用于SAM的检测未见报道。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的是将甲基转移酶固定玻碳电极上与电化学相结合，提供了一种固定甲基转移酶传感器的制备方法，并应用检测SAM中，采用电聚合法在玻碳电极表面电聚合聚3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁膜制备聚3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁电极，然后将甲基转移酶固定在聚3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁电极上，制备固定甲基转移酶电极传感器。
[0009]仪器与试剂
CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)，实验采用三电极体系:铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极(SCE)，玻碳电极(GCE)为工作电极；KQ_250E型超声波清洗器(坤峰超声仪器有限公司)。
[0010]3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁(Thi)，戊二醛(GA)，无水乙醇，甲基转移酶(E.C.2.1.1.3)，DNA, SAM ;硫酸，磷酸盐缓冲溶液，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
[0011]本发明的目的通过如下技术方案实现。
[0012]一种固甲基转移酶电极传感器的制备方法，特征在于该方法具有以下工艺步骤:
(1)电极活化处理:将玻碳电极，依次用0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3粉抛光，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗lOmin，以清洗后的玻碳电极做为工作电极，于0.5 mol Γ1的硫酸溶液中于-0.3到+1.5 V电位范围内进行扫描至稳定，得到活化玻碳电极；
(2)聚3，7-二氨基吩噻嗪-5-翁修饰电极制备:将含有0.11-0.15 mol L—1的3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁的pH值为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液通入氮气除氧lOmin，除氧后，将活化玻碳电极放入，采用计时电流法在电压为1.5 V下预阳激化240~280 s，再采用循环伏安扫描80圈，得到聚3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁修饰电极；
(3)甲基转移酶固定液的制备:在反应器中，按甲基转移酶与DNA质量比为1:1加入，甲基转移酶与DNA溶解在pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液中，溶液中含甲基转移酶与DNA的浓度都在12~15mg/mL范围内，该溶液为甲基转移酶固定液；
(4)固定甲基转移酶电极传感器的制备方法:将步骤(2)制备的聚3，7-二氨基吩噻嗪-5-翁修饰电极浸泡于步骤(3)制备的甲基转移酶固定液中8~10h，取出后，在5~8°C干燥，即得固定甲基转移酶电极传感器。
[0013]固定甲基转移酶电极传感器测定SAM步骤如下: (1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的SAM标准溶液，底液为PH7.2的磷酸盐缓冲溶液；
(2)将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的固定甲基转移酶电极传感器为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，采用计时电流法扫描该溶液，工作电压为-1.1V，取不同浓度下SAM的峰电流值与SAM浓度做工作曲线；
(3)SAM的检测:用待测样品代替步骤(I)中的SAM标准溶液，按照步骤(2)的方法进行检测，根据响应电流降低的差值Ζ Τ?Ρ工作曲线，得到待测样品中SAM的含量。
[0014]本发明的优点及效果是:
(I)本发明采用电化学聚合制备含有氨基膜电极，不需要氨基化，再将甲基转移酶固定上，制得固载甲基转移酶电极传感器，合成方法简单，成本低，不使用有毒的有机试剂；
(2 )该固定甲基转移酶电极传感器对SAM表现出很高选择性和灵敏性，响应电流与SAM的浓度在2~30 μ mo I /L范围内呈良好的线性关系，相关系数R=0.9986，检测限为3.65Xl(T6mol/L ；
(3)将本发明制备的固定甲基转移酶电极传感器成功用于药品、食品中SAM的检测中，解决了 SAM检测困难。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
(1)电极活化处理:将玻碳电极，依次用0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3粉抛光，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗lOmin，以清洗后的玻碳电极做为工作电极，于0.5 mol Γ1的硫酸溶液中于-0.3到+1.5 V电位范围内进行扫描至稳定，得到活化玻碳电极；
(2)聚3，7-二氨基吩噻嗪-5-翁修饰电极制备:将0.14 mol L—1的3，7-二氨基吩噻嗪-5-翁pH值为7.1磷酸盐缓冲溶液通入氮气除氧lOmin，除氧后，将活化玻碳电极放入，采用计时电流法在电压为1.5 V下预阳激化250 S，再采用循环伏安扫描80圈，得到聚3，7- 二氨基吩噻嗪-5-翁修饰电极；
(3)甲基转移酶固定液的制备:准确称取650mg甲基转移酶和650mgDNA于小烧杯中，加入20 mL左右pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液使其溶解，定量转移到50.0 mL的容量瓶中，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到甲基转移酶固定液；
(4)固定甲基转移酶电极传感器的制备方法:将步骤(2)制备的聚3，7-二氨基吩噻嗪-5-翁修饰电极浸泡于步骤(3)制备的甲基转移酶固定液中9h，取出后，在5~8°C干燥，即得固定甲基转移酶电极传感器。
[0016]实施例2
(1)电极活化处理:将玻碳电极，依次用0.3 Mm、0.05 Mm的Al2