一种百两金药材或其提取物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及中药材的质量控制，具体是百两金药材或其提取 物的检测方法。
【背景技术】
[0002] 百两金（Ardisia crispa(Thunb. )DC. A.)是紫金牛科（Myrsinaceae)紫金牛属 (Ardisia Sw.)常绿灌木植物，分布于四川、贵州、湖南、湖北、江西、浙江、福建、广东和广 西等地。以全株入药，具有清咽利喉、散淤消肿和舒筋活血的功效，并具有清热解毒、活血 舒筋、祛痰止咳和提脓生肌之功，我国民间多用于治疗咽喉痛、扁桃体炎、肾炎水肿、跌打损 伤、风湿疼痛、白浊、骨结核、劳伤咳血、痈疔和毒蛇咬伤等。现代药理研宄表明，本药材具有 细胞毒活性和抗肿瘤作用，同时具有抗炎、抑菌、收缩子宫、抗氧化等活性作用。百两金皂苷 B(ardisiacrispin B)是该药材主要活性成分之一，其化学结构式如下：
[0003]
[0004]目前对该属植物的研宄热点主要集中在化学成分、药理作用和临床应用等方 面，也有人建立了百两金药材中岩白菜素和百两金皂苷A含量测定的方法（侯金玲 等.HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A含量的方法研宄[J]广西医科 大学学报2014, 31(1) :50-54)，但未见百两金阜苷B的定量分析方法。由于岩白菜素和百 两金皂苷A在百两金药材中的含量水平较低（前者含量在0.08%~0.30% ;后者含量在 0. 25%~0. 31% )，增加含量水平更高的百两金皂苷B的检测方法，能更好的控制该药材的 内在质量。故我们从该药材中提取分离得到百两金皂苷B单体，并按照对照品研宄技术指 导原则进行了纯化及结构鉴定，最终建立起百两金药材或其提取物中百两金皂苷B的高效 液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD)的快速分析方法，提高了该药材或其提取物的质 量控制水平。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于：提供一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法 (HPLC-ELSD)测定百两金药材或其提取物中百两金皂苷B含量的检测方法，其特征在于以 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60 : 40~68 : 32的甲醇-水为流动相；蒸发 光散射检测器检测；理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000 ;其主要步骤还包括对照 品和样品溶液制备、进样分析测定并计算。
[0006] 根据前述的检测方法，其中，将红毛走马胎粉碎，用50%~80%的乙醇提取，将提 取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，用水和30%乙醇冲洗除杂，再用80%乙醇洗脱，洗脱液减 压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70 : 30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金 皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，用相应流动相溶解结晶物后注入制备型高效液相色 谱仪分离纯化；色谱条件：C18柱；流动相：体积比为60 : 40~68 : 32的甲醇-水；检测 波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，鉴定结构并检测纯度，即得。
[0007] 根据前述的检测方法，其中，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为80°C~ 110°C ;气体流速为 L 6 ~2. 4L · mirT1。
[0008] 根据前述的检测方法，其中，所述百两金药材或其提取物的供试品溶液是用 50 %~70 %的甲醇或乙醇水溶液提取制备，优选为50 %乙醇。
[0009] 5.根据前述的检测方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂苷B含量包括 如下步骤及优化条件：
[0010] 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D)测定：
[0011] 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水 (65 : 35)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于 5000 〇
[0012] 对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml 含0. 3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。
[0013] 供试品溶液制备取百两金药材粉末（过三号筛）〇.4g，精密称定，置具塞锥型瓶 中，精密加入50 %乙醇50mL，密塞，称定重量，超声（功率300W，频率40kHz)处理60分钟， 放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即 得。
[0014] 测定方法分别精密吸取对照品溶液5 μ L、20 μ L ;供试品溶液5~10 μ L ;注入液 相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
[0015] 本发明所提供的百两金药材或其提取物中百两金皂苷B含量的HPLC-ELSD检测方 法具有如下优点：
[0016] (1)本发明提供的方法首次引入了百两金药材或其提取物中有效成分百两金皂苷 B的含量测定，从而使百两金的质量控制方法更加科学合理；
[0017] (2)本发明所提供的的百两金药材或其提取物的分析方法首次将HPLC-ELSD法用 于百两金药材或其提取物中活性成分百两金皂苷B的含量测定，具有良好的线性关系、精 密度、重复性、稳定性、耐受性和回收率，测定简便快速。
【附图说明】
[0018] 图1为百两金皂苷B对照品溶液的HPLC-ELSD色谱图；
[0019] 图2为百两金药材的HPLC-ELSD色谱图；
[0020] 图3为百两金提取物的HPLC-ELSD色谱图。
【具体实施方式】
[0021] 1仪器、试药与样品
[0022] 高效液相色谱仪（美国Waters 515系列）；Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检 测器；制备型高效液相色谱仪（美国贝克曼库尔特BECHMAN 125P型），包含SYSTEM GOLD I25PSolvent Module 和 I66P Detector 等；Milli-Q超纯水器（美国 Milipore 公司）； Microfuge 18台式离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；KQ-500DE超声清洗机（昆山 市超声仪器有限公司，功率300W，频率40kHz) ;BP-210D型电子分析天平（德国赛多利斯， 十万分之一）；过滤装置（Autoscience)及微孔滤膜（0. 45 μm)。色谱柱：Alltech Altimma C18 (250mmX 4. 5mm, 5 μ m) ；ffaters Symmetry C18 (150mmX 4. 5mm, 5 μ m) ；Phenomenex Gemini C18(150mmX4.5mm，5ym);制备色谱柱：BECHMAN UL TRAPREP C18(21.1mmX150mm，10ym); 保护柱：phenomnex C18〇
[0023] 百两金皂苷B自制（熔点：263_265°C，薄层色谱多个展开及显色系统均显示一个 斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算其质量浓度大于98%，符合定量分析用对照品 纯度的质量要求）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水；其余试剂均为分析纯。百两金药材购 买于四川省某公司，经发明人鉴定为百两金（Ardisia crispa(Thunb.)DC.A.)。
[0024] 2百两金皂苷B对照品制备
[0025] 将红毛走马胎粉碎，用50 %~80 %的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附 树脂，用水和30 %乙醇冲洗除杂，再用80 %乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层 析，以体积比为70 : 30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂， 甲醇重结晶，用相应流动相溶解结晶物使成饱和溶液，上清液注入制备型高效液相色谱仪 分离纯化；色谱条件：C18柱；流动相：体积比为60 : 40~68 : 32的甲醇-水；检测波长： 205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，即得。
[0026] 将制得的百两金皂苷B对照品采用高分辨质谱（HR-FAB-MS)给出精确分子量： m/zl097. 5432[M+Na]，对应分子式为！C53H86O22Na(分子量计算值为：1097. 5509);其碳、 氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为西 克拉敏Α3-0_α-鼠李吡喃糖-(1 - 2)-f3_D-葡萄吡喃糖-(1 - 4)-[f3_D-葡萄吡喃 糖-(1 - 2)-]-a-L-阿拉伯吡喃糖苷。
[0027] 本发明制备的虎舌红素 B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)纯度 检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定， 其质量分数均大于98%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。
[0028] 3方法优化
[0029] 3. 1蒸发光散射检测器参数优化
[0030] 其主要参数有漂移管温度和气体流速，以5°C为递增值，考察漂移管温度