染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及刑侦领域的毒物检测方法，特别涉及染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦 含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 唑吡坦（Zolpidem):商品名思诺思，为咪唑并吡啶类催眠药。化学名N，N，6-三甲 基-2-(4-甲苯基）咪唑并[l，2_a]_吡啶-3-乙酰胺，化学结构如下：
[0004] 一般将唑吡坦制成酒石酸盐，为无色无臭黄白色结晶性固体，微溶于水、乙醇和丙 二醇，呈弱碱性，pKa值为6. 2。口服吸收迅速，具有很高的血浆蛋白结合率（92. 5% )，可通 过血脑屏障，脑脊液浓度为血浓度的30~50%，其代谢产物无药理活性，只有不到1 %的原 药从尿中排出。与苯二氮卓类催眠药相比，对受体结合部位有高度选择性，服药后产生明 显的催眠镇静作用，而副作用和不良反应则小的多。虽然唑吡坦安全范围较大，但大剂量 服用也致中毒。中毒表现为不同程度的嗜睡、头昏、乏力，共济失调，恶心，呕吐，个别表现为 兴奋，多语。严重者可引起昏迷，血压下降，休克，呼吸循环抑制，死亡等。口服大量唑吡坦 急性中毒死亡的，往往可同时检出其它镇静安眠药或抗抑郁药物或乙醇。因此不能确定此 类药物确切的中毒量和致死量数据。
[0005] 近年来在毒物分析鉴定中出现一些利用唑吡坦实施自杀、麻醉抢劫、麻醉凶杀、麻 醉强奸的刑事案件。由于该药起效快消除快的代谢特点，给痕量检测提出了较高的要求。但 是，目前尚无人体或其它动物体内唑吡坦的染毒分布数据，特别是固体组织（如心、肝、肾、 脾、肺、脑或肌肉组织）中的染毒分布数据，急需建立动物体（包括人体）内唑吡坦的染毒 分布数据，唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明在于提供一种染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方 法，建立动染毒大鼠固体组织，尤其是心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织中唑吡坦的染毒分布 数据，为唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测 方法，包括如下步骤：
[0008] (1)样品萃取：取剪碎的心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品，采用液液萃取，将 心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中的唑吡坦萃取出来；
[0009] (2)仪器检测：利用GC/NH)仪、GC/MS仪或LC-MS/MS仪对萃取物进行定性和定量 检测，确定心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中唑吡坦的含量。
[0010] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（1)中的液液萃取 包括如下步骤：加入有机溶剂和缓冲溶液，振荡混匀，分离有机相，再加入有机相进行第二 次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用甲醇定容，转移至进样瓶内，供 气相色谱或气相色谱-质谱仪分析；若供液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用甲醇定容， 用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内，供液相色谱-串联质谱仪分析检测。
[0011] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（1)中的液液萃取 包括如下步骤：
[0012] 向心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织样品中加入甲醇，每克固体组织中加入0.2mL 甲醇，混旋，再加入硼砂-氢氧化钠缓冲液或氢氧化钠溶液调节pH为9~10,振荡混匀； 每1克固体组织样品加入5mL~10mL的有机溶剂，振荡10min，8000rpm离心lOmin;分离 有机相后，再加入5mL~10mL的有机溶剂进行第二次提取，分离，合并两次有机相；残渣加 入50yL~100yL甲醇定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱仪分析；若供 液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣用200yL~1000yL甲醇定容，用微孔有机滤膜过滤 并转移至进样瓶内，供供液相色谱-串联质谱仪分析检测。
[0013] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，所述有机溶剂为二氯甲 烷；或乙酸乙酯；或者二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为 1 :4 ;或乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶液，乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基 乙烯基醚体积比为2:1:1 ;或二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的混合溶 液，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮和丁基乙烯基醚的体积比为1:2:1: 1。
[0014] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中，GC/NPD 仪条件：a)色谱柱：DB-1柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程：200°C保持lmin，以 10°C/min速率升温至280°C，保持lOmin;c)进样口温度：280°C;d)检测器温度：300°C;e) 载气：氮气，纯度 > 99. 999%;f)分流比：5:1 ~50:1 ;g)柱流量：1.OmL/min~2.OmL/min。
[0015] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中，GC/MS仪 条件：a)色谱柱：DB-1MS柱，30mX0. 32mmX0. 25ym;b)色谱柱温程：100°C保持2min，以 15°C/min速率升温至280°C，保持17min;c)进样口温度：280°C;d)传输线温度：230°C;e) 离子源温度：200°C;f)载气：高纯氦气，纯度> 99. 999%;g)柱流量：lmL/min~2mL/min; h)分流比：5:1~50:1 ;i)质量扫描范围：40amu~450amu;j)扫描方式：全扫描SCAN。
[0016] 上述染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法，在步骤（2)中：液相色 谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器，扫描方式：正离子扫 描ESI+ ;检测方式：多反应监测MRM;电喷雾电压：5500KV;离子源温度：650°C;雾化气压 力：55psi;气帘气压力：30psi;辅助气压力：50psi;色谱柱为ZORBAXEclipsePlusC18， 2.1_^10〇111111，1.8 11111;流动相六为含0.1%甲酸的51111醋酸铵，流动相8为乙腈；以流动相 B的比例进行说明梯度洗脱条件如下：初始体积10%保持0.lmin后，1.Omin增至60%保持 1.Omin，2.lmin下降至 10%并保持 1. 9min。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明染毒大鼠体内固体组织中唑吡坦含量的检测方法， 建立动染毒大鼠固体组织，尤其是心、肝、肾、脾、肺、脑或肌肉组织中唑吡坦的染毒分布数 据，可以为唑吡坦的刑侦技术检测提供参考。
【附图说明】
[0018] 图1灌注唑吡坦大鼠的实验设计图；
[0019] 图2血样中唑吡坦色谱图；
[0020] 图3肝组织中唑吡坦色谱图；
[0021] 图4血添加工作曲线；
[0022] 图5肝添加工作曲线；
[0023] 图6 0. 5h急性染毒大鼠体内各组织及血液中唑吡坦含量；
[0024] 图7急性染毒大鼠体内血药浓度唑吡坦变化趋势；
[0025] 图8急性染毒大鼠体内肝药浓度唑吡坦变化趋势；
[0026] 图9唑吡坦的平均血药浓度-时间曲线（n= 6);
[0027] 图10唑吡坦的总离子流图（RT12. 7);
[0028] 图 11 唑吡坦的质谱图（m/z235, 236, 307);
[0029] 图12唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图（RT1. 66)。
【具体实施方式】
[0030] 为清楚说明本发明中的方案，下面给出优选的实施例并结合附图详细说明。
[0031] 一、试剂
[0032] a)二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基甲基酮、丁基乙烯基醚、硼砂、磷酸二氢钠、磷酸氢二 钠、氢氧化钠等溶剂均为分析纯；唑吡坦购于国家麻醉品实验室；灌胃液的配制：称量唑吡 坦600mg溶于60mL生理盐水中，混勾，配制成10mg/mL的灌胃液；
[0033] b)甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵等溶剂均为色谱纯；
[0034] c)磷酸盐缓冲液（pH= 6):取磷酸氢二钠（Na2HP04 ? 12H20)8. 812g，磷酸二氢钠 (NaH2P04 ? 2H20)27. 37g，加入一定量的一级水溶解并稀释至lOOOmL;
[0035] d)硼砂-氢氧化钠缓冲液（pH= 10):取硼砂（Na2B407 ? 10H20)试剂2. 38g，氢 氧化钠试剂0. 86g,加入100mL-级水溶解并稀释至500mL;
[0036] e)含0. 1%甲酸的5mM醋酸铵：称取0. 192g的醋酸铵，加入一定量的一级水溶 解，并加入〇. 5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL;
[0037] f)标准储备液：精确称取唑吡坦标准品50mg于50mL容量瓶中，加一定量甲醇溶 解并稀释至刻度，摇匀，配制成l.Omg/mL唑吡坦标准储备液，置于冰箱中冷冻保存6个月；
[0038] g)标准工作液：精确量取唑吡坦标准储备液1.OmL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释 至刻度，配制成100.0yg/mL的唑吡坦标准工作液。4°C冷藏保存3个月。试验中所用其它 浓度的标准溶液均从上述标准储备溶液中用甲醇稀释制备，并冷藏保存3个月。
[0039] 二、仪器和材料
[0040] a)气相色谱仪：配有氮磷检测器（NPD);
[0041] b)气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI);
[0042] c)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器；
[0043] d)电子天平：感量0?lmg;
[0044]e)高速离心机；
[0045]f)振荡器；
[0046]g)浓缩仪；
[0047]h)固相萃取柱：0a.SisWlILB柱（3CC, 60mg)，购自water