一种卡那霉素的化学发光试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测卡那霉素的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测牛奶、奶粉 中的卡那霉素含量或残留量。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 卡那霉素是一种高效、广谱的氨基糖苷类抗生素，在治疗由革兰氏菌引起的感染 方面具有许多优点，其在动物中广泛应用的一个主要后果就是在动物性食品中抗生素的非 法残留。如果长期摄入含有药物残留的动物性食品，这些药物就可在体内蓄积，产生慢性毒 害作用，氨基糖苷类抗生素均有潜在的耳毒性，可引起前庭功能障碍和听力永久丧失。
[0003] 目前，测定卡那霉素的主要方法是微生物法、高效液相色谱、酶联免疫吸附法等。 色谱技术是非常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从 样品预处理到得出检验结果需要较长时间，检测费用很高；另一方面这种检测方法还必须 有昂贵的仪器设备，只有特定的专业人员才能应用，而且每次检测的样品有限，不适应大批 样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应用，更不适合于现场检验。与之相比，化学发 光免疫法具有快速、灵敏、方便、检测成本较低等特点，能最大限度地减少操作误差和工作 强度，是一种非常适合基层检测牛奶、奶粉中卡那霉素的筛选方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种卡那霉素的化学发光检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵 敏度高、应用灵活、方便的特点，可用于牛奶、奶粉等样品中卡那霉素的残留量检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来 实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学 发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中卡那霉素含量越 高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中卡那霉素含量越少，发光强度越高。
[0006] 本发明的检测卡那霉素的化学发光免疫检测试剂盒含有盒体，设在盒体内的化学 发光板和设在盒体内的试剂。具体含有以下成分：
[0007] 包被有抗卡那霉素抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发 光板。
[0008] 应用pH= 7. 4 0. 05mol/L的PBS溶液稀释卡那霉素纯品得到的卡那霉素系列标 准品溶液，浓度范围至少包含了 〇. 05~4. 05ng/mL的浓度区间。
[0009] 酶标抗原浓缩液：由卡那霉素与卵清蛋白偶合制成的人工抗原与辣根过氧化物酶 偶联制备得到。
[0010] 酶标抗原稀释液：pH7. 6的0. 01M的磷酸钠、0. 25M的NaCl溶液。
[0011] 发光底物液：发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强 剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
[0012] 浓缩复溶液：浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至 工作浓度后使用，用于样品前处理。
[0013] 浓缩洗涤液：浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20 (Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷 酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。 [0014] 本发明溶液的配制：
[0015] 本发明试剂盒中涉及的卡那霉素标准品溶液、酶标卡那霉素抗原溶液、化学发光 溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分 及其配制方法是：
[0016] 1、卡那霉素标准溶液：以常规方法将卡那霉素纯品用0. 05mol/L，pH= 7. 4的PBS 配制成浓度分别为〇、〇. 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL的卡那霉素标准溶液。
[0017] 2、酶标卡那霉素抗原溶液：用卡那霉素与偶联蛋白偶联制备的人工抗原与辣根过 氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标卡那霉素抗原用酶标卡那霉素稀释液稀释成1:4000 的工作浓度。
[0018] 3、酶标抗原稀释液：为pH7. 6的磷酸钠为0? 01M、NaCl为0? 25M的缓冲溶液。
[0019] 4、化学发光溶液:A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酚含量为0. 001MpH= 8. 8 的三（羟甲基）氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HP042. 82g， 0. 75%的过氧化氢脲0. 64mL的水溶液。
[0020] 5、浓缩复溶工作液：NaH2P04 ? 2H20 5. 74g、Na2HP04 ? 12H20 32. 6g溶于 1L的去离子 水中。
[0021] 6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0. 05 %将吐温-20添加至pH= 7. 4,0.lmol/L磷酸 盐缓冲液中。
[0022] 7、包被溶液：1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH= 9. 5。
[0023] 8、封闭溶液配制：10gBSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5%。的NaN3。
[0024] 本发明化学发光板的包被：
[0025] 本发明中包被化学发光板采用将抗卡那霉素抗体置于设定的包被溶液中，以设定 的浓度，在37 °C恒温箱中反应包被。
[0026] 本发明采用的是pH= 9. 5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所 包被的抗卡那霉素抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次 洗板，采用的抗体包被浓度为5. 0yg/mL。
[0027] 包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入似％防 止变质。
[0028] 酶标卡那霉素抗原溶液的制备：
[0029] 本发明中酶标卡那霉素抗原溶液浓度是决定本发明中卡那霉素化学发光检测试 剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
[0030] 本发明中涉及的酶标卡那霉素抗原溶液可以用酶标卡那霉素稀释液稀释成 1:4000的工作浓度。
[0031] 按照上述酶标卡那霉素抗原溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围 (标准线范围可以达到0. 05~4. 05ng/mL)和很好的灵敏度（IC5Q为0. 065ng/mL)。
[0032] 化学发光溶液的配制：
[0033] 所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酚含量为0. 001MpH= 8. 8的 三（羟甲基）氨基甲烷溶液，B液为lOOmL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75% 的过氧化氢脲0. 64mL的水溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。 [0034] 本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起 来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
[0035] 本发明的化学发光检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比 色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在牛奶、奶粉中的卡那霉素残留检测中 发挥重要作用。
【附图说明】
[0036] 图1为卡那霉素半抗原合成反应式。
[0037] 图2为卡那霉素半抗原核磁共振氢谱图。
[0038] 图3为本发明化学发光试剂盒工作曲线。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1 :半抗原、抗原及单克隆抗体的制备
[0040] (1)卡那霉素半抗原合成
[0041] 1. 0g卡那霉素、0. 3g邻苯二甲酸酐和2ml吡啶在10mlDMF中的混合液，室温下搅 拌反应12小时，减压蒸除溶剂，乙醇中重结晶得到邻苯二甲酸单卡那霉素酰胺，得率53%。
[0042] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，8.Oppm左右的芳香烃信号和 11.Oppm羧基峰信号的出现说明半抗原合成成功。
[0043] (2)免疫原（卡那霉素-BSA)的合成
[0044] 取20mg半抗原，溶解于lmLDMF中，取30mgEDC和NHS用0. 2ml水充分溶解后 于加入⑴中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mL PBS(PH7. 2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.Olmol/ 1PBS4度透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20°C保存备 用。
[0045] 称取半抗原20mg和OVA50mg，按上述步骤反应制备包被抗原，供酶标用。
[0046] (3)卡那霉素单克隆抗体的制备
[0047] A，动物免疫：用上述制备出的免疫原（卡那霉素-BSA)按100yg/只，以生理盐水 溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初 次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3 天以免疫复合物100Ug/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0048] B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨 髓瘤细胞（SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT 培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5 %C02培养箱中培 养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0049] C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛 选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其 最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被化学发光板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加 入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方 法筛选，先将细胞上清与l〇〇yg/mL的卡那霉素等体积混合，37°C水浴作用30min，再加入 到包被好的化学发光板中。同时用PBS取代卡那霉素作对照，其余步骤同上。若经卡那霉 素阻断后的〇D45(lnm值下降到对照孔的50%以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的 孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
[0050] D，单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液 用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/只， 7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2X106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清， 测定效价，并冻存备用。
[0051] 实施例2 :酶标抗原的制备
[0052] A，称取2mgHRP溶解于0. 5mL双蒸水中；加入0. 5mL新配制的0. 06mol/L恥104溶 液，4°C避光作用30min;
[0053] B，加入 160mmol/L的乙二醇 0? 5mL，室温作用 30min;
[0054] C，加入卡那霉素-OVA2mg，混勾后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0. 05m mol/L碳酸钠缓冲液中透析，4°C过夜；
[0055] D，透析液吸至10mL的离心管中，加0. 25