一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的联合检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病原菌的检测技术领域，设及一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的 联合检测方法，具体为嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的双标记时间分辨巧光免疫检测方 法。
【背景技术】
[000引 嗜水气单胞菌（Aeromonashy化ophila)是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌， 可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻（沈锦玉.嗜水气单胞菌的研究进展，浙江海洋 学院学报.2008, 27:78-86)。产酸克雷伯氏菌化lebsiellaox^oca)是一种条件致病菌， 可引起腹泻及食物中毒（于兰，等.一起产酸克雷伯氏菌引起食物中毒的调查，解放军预 防医学杂志，2003, 21:69)，此外会引起媛綱皮肤点状出血。由于在病理检验、水产养殖等领 域均可检测到该两种病原菌，因此开展嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的同时检测对疾病 防治具有重要意义。
[0003] 传统检测病原菌的方法是酶联免疫吸附法巧LISA)和巧光抗体法，该些方法具有 特异性强的优点，但灵敏度不高，同时测量光谱范围宽，双标记免疫检测会互相干扰，不适 于两种菌的测量。时间分辨巧光免疫检测（TRFIA)巧光发射光谱窄，双标记法测量两种病 原菌光谱互不重叠，此外采用长寿命的稀±馨合物标记，通过时间延迟消除背景干扰，灵敏 度大为提高。但TRFIA在病原菌检测中应用不多（卢洁，等.时间分辨巧光免疫法检测日 本島曼綱产酸克雷伯氏菌，分析化学，2012, 40:1709-1714)，双标记同时测定两种病原菌更 是未见报道。本方法采用TRFIA检测嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌，两种病原菌的检测 灵敏度均得到了提高，由于是同时检测，简化了步骤，节省了时间。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的双标记时间分辨 巧光免疫检测方法。
[0005] 本发明具体通过W下技术方案实现：
[0006] 一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的联合检测方法，具体通过W下步骤完成：
[0007] 1)用碳酸盐包被液分别稀释抗嗜水气单胞菌抗体IgGl和抗产酸克雷伯氏菌抗体 IgG2,加入96孔微孔板，洗漆；
[000引 2)每孔加入200yL的1 %BSA，37°C封闭2h，洗漆；
[0009] 3)每孔加入用分析缓冲液稀释的嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌混合菌悬液，阴 性对照孔W分析缓冲液代替，37°C振荡解育比，洗漆；
[0010] 4)将工作浓度的Sm3+-IgGl和Eu3+-IgG2等体积混合，每孔加入100yL，25°C振荡 解育90min，洗漆；
[0011] W每孔加入200yL增强液，室温振荡15min;
[0012] 6)多标记分析仪上测量时间分辨巧光TRF，测量参数设置为延迟时间0. 4ms，测量 时间0. 4ms，嗜水气单胞菌检测固定激发波长340nm，发射波长642nm，产酸克雷伯氏菌检测 固定激发波长340皿，发射波长615皿。
[001引 7)W样品孔的TRF值（巧与对照孔的TRF值㈱之比大于2 (即P/N〉。时判断为 阳性。
[0014] 步骤（1)具体为碳酸盐包被液稀释两种抗体，等浓度等体积混合，每孔100y以 4°C包被 12h。
[0015] 本发明检测方法中两种包被抗体的浓度均为1 y g/mL。
[0016] 本发明所述的Sm3+-IgGl的稀释度为1:600,化3+-IgG2的稀释度为1:1280。
[0017] 本发明所述的碳酸盐包被液通过W下组分制备；Na2C〇3l.49g，NaHOy. 93g， NaNgO. 2g，去离子&0定容至IL。
[0018] 本发明所述的分析缓冲液通过W下组分制备；Tris-base6. 057g，Tween-201血， BSA2g，DTPA0. 0196g，化Cl9g，NaN3〇. 5g，去离子&0定容至800血，浓盐酸调抑值到7. 8， 去离子&0定容至1L。
[0019] 本发明所述的洗漆采用的洗漆缓冲液通过W下组分制备；Tris-base6.057g， Tween-202血，化Cl9g，NaNgO. 5g，去离子&0定容至800血，浓盐酸调抑值到7. 8,去离子 &0定容至1L。
[0020] 本发明所述的增强液通过W下组分制备；TritonX-lOOlmL，0-NTA3. 99mg，T0P0 19. 33mg，邻苯二甲酸氨钟1.3g，冰醋酸6血，去离子&0定容至IL。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] 1)采用双标记TRFIA法同时检测嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌国内外均未见 报道。
[002引。与分别检测两种病原菌相比，该方法大大缩短了分析检测时间，降低了检测成 本。
[0024] 3)检测嗜水气单胞菌的灵敏度为6.0 X104c化/mU产酸克雷伯氏菌的灵敏度为 1. 0X 104cfu/mL，高于ELISA法与巧光抗体法。
[0025] 4)通过时间分辨巧光TRF与菌浓度的工作曲线，可W看出该法线性范围宽，不仅 能够进行定性检测，还可进行定量检测。
【附图说明】
[0026]图1是Snf-IgGl的浓度对检测信号的影响；横坐标是嗜水气单胞菌浓度的对数， 纵坐标是时间分辨巧光TRF的对数；
[0027]图2是化3+-IgG2的浓度对检测信号的影响；横坐标是产酸克雷伯氏菌浓度的对 数，纵坐标是时间分辨巧光TRF的对数；
[002引图3是双标记TRFIA法测定两种菌的标准曲线；横坐标是菌浓度的对数，纵坐标是 时间分辨巧光TRF的对数；
[0029] 图4是双标记TRFIA法检测嗜水气单胞菌；纵坐标是P/N，横坐标代表6条媛綱的 5种组织；
[0030] 图5是化ISA法检测嗜水气单胞菌；纵坐标是P/N，横坐标代表6条媛綱的5种组 织；
[0031] 图6是双标记TRFIA法检测产酸克雷伯氏菌；纵坐标是P/N，横坐标代表6条媛綱 的5种组织；
[0032] 图7是化ISA法检测产酸克雷伯氏菌；纵坐标是P/N，横坐标代表6条媛綱的5种 组织。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，W下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0034] 实验材料；
[0035] 96孔白色微孔板购自厦口怡佳美公司；SPA亲和层析柱、S巧hadexG-50购自GE Healthcare公司；牛血清白蛋白炬SA)、|3-NTA、TOPO,购自Sigma公司；Eu3+标记试剂盒 (1244-302)、Sm3+标记试剂盒（1244-303)购自Perkins-Elmer公司；其它相关试剂均为国 产分析纯。
[0036] 产酸克雷伯氏菌菌株分离于皮肤点状出血的日本媛綱，并经Biolog自动生化鉴 定系统佑enelll)鉴定，已于2011年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中屯、，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 分类命名是1^166316113〇义八〇〇3，保藏中屯、登记入册编号为〔6版^齡.5060;嗜水气单胞菌 菌株可于北京北纳创联生物技术研究院得到；媛綱购自集美大学水产试验场。交叉实验所 用菌株均来自西班牙普通微生保藏中屯、（CECT)。
[0037] 实验试剂：
[003引碳酸盐包被液通过W下组分制备；NasCOsl.49g，NaHC032. 93g，NaN30. 2g，去离子&0 定容至IL。
[0039] 分析缓冲液通过W下组分制备；Tris-base6. 057g，Tween-201mLBSA2g，DTPA 0. 0196g，化Cl9g，NaNjO. 5g，去离子&0定容至800血，浓盐酸调抑值到7. 8,去离子&0定 容至1L。
[0040] 洗漆缓冲液通过W下组分制备；Tris-base6. 057g，Tween-202mL化〔1 9g， NaNsO. 5g，去离子&0定容至800血，浓盐酸调抑值到7. 8,去离子&0定容至IL。
[00川 增强液通过W下组分制备；TritonX-lOOlmL，0-NTA3. 99mg，T0P0 19