同时检测小鼠血液和肝脏组织中脂肪酸含量的气相色谱方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及气相色谱方法，尤其涉及同时检测小鼠血液和肝脏组织中脂肪酸含量 的气相色谱方法，属于脂肪酸含量的气相色谱检测领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸是天然油脂与水发生分解反应生成的脂肪族羧酸化合物，是脂类的重要组 成部分，所以脂肪酸的性质会极大地影响甘油三酯、磷酯和糖脂等的特性。目前发现的天然 脂肪酸有200多种，广泛存在于动植物油脂中。根据分子结构中碳原子的数目，可分为短链 脂肪酸（2~6)、中链脂肪酸（8~12)、长链脂肪酸（14~26);根据碳原子双键的数目（饱 和度）可分为饱和脂肪酸（SFA)、单不饱和脂肪酸（MUFA)和多不饱和脂肪酸（PUFA);随着 营养科学的发展，发现双键所在的位置会影响脂肪酸的营养价值，因此又按其双键位置不 同将不饱和脂肪酸进行分类。根据甲基端第一个双键所连接碳原子的编号可分为n-3族、 n-6族、n-7族、n-9族（也可用《编号）。其中，n-3族和n-6族不饱和脂肪酸与人类的健 康密切相关，具有重要的生物学意义。
[0003] 气相色谱法是脂肪酸分析中最常用的方法，也是国际标准化组织（ISO)和美国油 脂化学学会标准（A0CS)中所采用的方法。从组织中提取出的脂肪酸（特别是12碳以上的 长碳链脂肪酸），由于沸点高、极性强、高温下不稳定，分析中易造成损失。因此，对脂肪酸组 分分析时，必须把脂肪酸类脂键断开，得到的游离脂肪酸经衍生化后生成较易挥发、极性偏 弱的衍生物才能进行气相色谱（GC)分析。
[0004] 研宄表明脂肪酸与胰岛素抵抗、冠状动脉疾病、高血压、肥胖等慢性病密切相关。 因此，建立血清及肝组织中脂肪酸的定性、定量及快速检测方法对医学基础研宄及临床检 验均具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是建立一种同时检测小鼠血液和肝脏组织中脂肪酸 含量的气相色谱方法，该方法适于检测的脂肪酸种类多、沸点范围较大，分离效果好，具有 准确度好、重现性稳定、灵敏度高等优点。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] 本发明公开了一种同时检测小鼠血液和肝脏组织中脂肪酸含量的气相色谱方法， 包括以下步骤：（1)采集待检测小鼠的血液，分离血清；或者，提取待检测小鼠肝脏组织中 的脂肪酸；（2)将步骤（1)所分离的血清或提取的脂肪酸进行皂化甲酯化；（3)采用气相色 谱进行定性定量测定。
[0008] 其中，步骤（1)采用Folch法提取待检测小鼠肝脏组织中的脂肪酸。经过两次抽 提，此种方法损失较小，提取全面，效果比较好。
[0009] 作为参考：取肝脏组织100mg，将肝脏组织剪碎置匀浆器中，加入lmL生理盐水， 冰浴中研磨成匀浆，加入三氯甲烷2mL、甲醇lmL，充分混匀，共重复两次，合并两次提取液， 3000r/mim离心lOmin，除去上层液相，下层有机相在氮气流吹干，置-20°C冰箱中保存备 用。
[0010] 本发明在血清的处理中，分别采用了经典的Floch法和直接甲酯化的方式，经过 检测脂肪酸含量，发现二者差别不显著，因此采用了省时省力的直接甲酯化的方式。
[0011] 本发明方法步骤⑵所述皂化甲酯化采用的试剂为质量分数13%BF3-甲醇溶液； 所述皂化甲酯化的温度为40-KKTC;优选为60°C;皂化甲酯化的时间为30-60min;优选为 40min〇
[0012] 作为本发明的优选技术方案，所述皂化甲酯化的操作为：
[0013] 取肝脏组织100mg，采用Folch法提取脂肪酸；或者，血清lOOyL;然后，加 0? 5mol/LK0H-甲醇溶液lmL，充氮气密封，60°C水浴10min，加13%BF3-甲醇溶液1. 5mL， 60°C水浴40min，取出置冷，加入正己烷1. 5mL，涡流lmin提取。加入饱和氯化钠溶液2mL， 离心3000r/min，15min，静置5min，取上层液于螺口试管中，吹入氮气，密封，4°C冰箱保存。
[0014] 本发明方法步骤（3)所述气相色谱的条件包括：毛细管色谱柱为DB-23毛细管柱， 规格为 30mX0. 25mmX0. 25ym;载气为氮气（99. 999%):流速50mL/min;氢气：流速50mL/ min，空气：流速500mL/min;进样量为1yL;分流比为1 :30 ;进样器温度240°C;检测器温度 260。。。
[0015] 升温程序为：初始柱温50°C，保持2min，升温速率15-22°C/min，升到170°C保 持lmin，1-10°C/min升至240°C保持10min;优选为，初始柱温50°C，保持2min，升温速率 20°C/min，升到 170°C保持lmin，2°C/min升至 240°C保持 10min。
[0016] 本发明方法适于检测的脂肪酸种类包括：C12:0、C14:0、C15:0、C16:0、C17:0、 C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C22:0、C23:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C22:6〇
[0017] 本发明根据待检测脂肪酸与脂肪酸标准品的保留时间一致，确定为目标脂肪酸； 根据脂肪酸标准品浓度与色谱峰面积做线性回归，得到相应的线性回归方程，根据小鼠血 清或肝脏组织中脂肪酸的峰面积带到相应的线性回归方程，计算目标脂肪酸的相应浓度。
[0018] 本发明对皂化甲酯化的温度、时间进行了优化实验。水浴温度分别为40、50、60、 70、80、90、100°〇，加热401^11，气相色谱升温程序为 ：初始柱温501：，保持21^11，升温速率 20°C/min，升到170°C保持lmin，2°C/min升至240°C保持10min;观察脂肪酸含量与水浴 温度的关系。结果表明，同种脂肪酸在水浴温度60°C的峰面积比40、50、70、80、90和100°C 的峰面积大，且差异显著（P〈〇. 01或P〈〇. 05)。
[0019]本发明进一步在水浴温度为60°C条件下，加热30、35、40、45、50、55、60min进行单 因素试验，考察脂肪酸含量与水浴时间的关系。结果表明，同种脂肪酸在加热40min的峰面 积比加热30、35、45、50、55和60min的峰面积大，差异显著（P〈0. 01或P〈0. 05)。
[0020] 本发明还对色谱条件的升温程序进行优化，分别设计了 7种升温程序，考察对饱 和、不饱和脂肪酸峰面积的影响。结果表明，升温程序为：初始柱温50°C，保持2min，升温速 率20°C/min，升到170°C保持lmin，2°C/min升至240°C保持10min的条件下，同种脂肪酸 的峰面积分别大于其他6种升温程序，差异显著（P〈0. 01或P〈0. 05)。
[0021] 应用本发明方法检测的小鼠血清和肝脏中脂肪酸的平均回收率分别在81. 53%~ 100. 72%和 80. 72%~100. 62%，精密度分别在 0? 44%~5. 51%和 0? 58%~5. 74%;脂肪 酸的检测限在100~300ng/mL，定量限在150~500ng/mL。
[0022] 应用本发明同时检测小鼠血液和肝脏组织中脂肪酸含量的气相色谱方法，检测 NAFLD小鼠血清和肝脏中脂肪酸的含量。结果表明，NAFLD小鼠肝脏中占主要含量的C16: 0、 C18:0、C18:1和C18:2等呈现显著地上升，而C22:6的含量有所下降，提示肝脏中脂肪酸代 谢的明显异常。