一种基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒及方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，具体地涉及一种基于化学发光法检测LP-PLA2和CRP 含量的试剂盒及方法和应用。
【背景技术】
[0002] 缺血性脑卒中是临床上的一种常见病、多发病，其常见的病因为动脉粥样硬化导 致管腔狭窄和脑血栓形成，造成局部脑供血区血流中断，发生脑组织缺血、缺氧、软化坏死。 大量研宄标明动脉粥样硬化本身是一个炎症的过程，持续的低水平炎症预示着心脑血管疾 病发生的可能性。Lp-PLA2为新近发现的炎症标志物，属于磷脂酶A2超家族中的非钙离子 依赖型磷酸酯酶，主要由炎症细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞等）分泌，并受炎症介质的调节。 CRP是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，是心脑血管疾病最强 有力的预测因子之一，对心血管、脑血管以及外周血管疾病有着最好的预测及预后效果。
[0003] 有研宄表明，缺血性脑卒中发生后，患者LP-PLA2及CRP水平都明显升高，其水平 随神经功能缺损程度增加而呈递增趋势，差异有统计学意义。同时血清CRP水平对预测脑 梗死体积也具有重要意义。Lp-PLA2及CRP的同时检测有助于更加全面地判断脑梗的严重 程度并对其防治与预后提供实验室参考。
[0004] 目前通过联合检测LP-PLA2与CRP两个指标实现对缺血性脑卒中的诊断的检测方 法主要有胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫吸附试验（ELISA)等。胶乳增强免疫比浊法存在 检测线性范围窄、阳性率低等缺点；ELISA法存在灵敏度低、线性范围窄、不易实现全自动 化等缺陷；从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。目前化学发光免 疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种基于化学发光法的基于化学发光法检测 Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒，该检测试剂盒的检测具有简便、快速、灵敏度高、线性范围宽 和稳定性好等优点，可以有效地用于脑卒中发生后神经功能损伤程度和梗死体积评价。
[0006] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于化学发光法的基于化 学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒，所述的试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆 抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体、异硫氰酸荧光素标记的 CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗 体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、稀释液、清洗液、Lp-PLA2系列校准品和CRP 系列校准品。本发明的试剂盒的反应试管的材料选自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中 的至少一种。
[0007] 其中，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒由羧基修饰的磁微粒 表面共价结合抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体制备得到，其中，所述的磁微粒粒径为0. 7~ 1ym，内核为四氧化三铁表面包裹有羧基基团。在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含 的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的待测样品基质中 快速分离、纯化出目的待测物是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是 利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法 包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可 重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外 加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
[0008] 具体地，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于所述稀释液 中，配制成0. 5~2yg/mL的磁微粒溶液；所述异硫氰酸荧光素标记的LP-PLA2单克隆 抗体和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0. 25~ 0. 5yg/mL异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和0. 25~0. 5yg/mL异硫氰酸 荧光素标记的CRP单克隆抗体溶液；所述的碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性 磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0. 25~0. 5yg/mL碱性磷 酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶液。
[0009] 优选地，所述的异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和异硫氰酸荧光 素标记的CRP单克隆抗体溶液通过透析法制备得到。
[0010] 优选地，所述的碱性磷酸酶标记的LP-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP 单克隆抗体通过分别活化Lp-PLA2单克隆抗体、CRP单克隆抗体以及碱性磷酸酶溶液后，分 别将活化后的Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶溶液混合后得 到。
[0011] 所述的化学发光底物液为〇. 1~〇. 3M、pH值为8~10的Tris-HCl缓冲液，所述 化学发光底物液含有〇. 2~0. 4mg/mL的二氧杂环乙烷。
[0012] 所述的稀释液为0? 05~0? 5M、pH值为7. 0~8. 0的Tris-HCl缓冲液且所述稀释 液含0. 4~0. 6wt%的牛血清白蛋白BSA和0. 05~0. 3wt%的叠氮化钠；所述的清洗液为 0. 1~0. 2M、pH值为8~9的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液含有0. 01~0. 04wt% 的吐温20和15~20wt%的氯化钠。
[0013] 所述的LP-PLA2系列校准品和CRP系列校准品的浓度范围分别为0~50ng/mL和 0 ~100ng/mL〇
[0014] 本发明还提出了一种利用上述的试剂盒来检测LP-PLA2和CRP含量的方法，其特 征在于，包括如下步骤：
[0015] (1)将试剂盒中的所有试剂取出后平衡到室温；使用前将抗FITC多克隆抗体包 被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液稀释，混匀；设定好 37°C水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；
[0016] (2)待测样本或校准品、FITC标记的LP-PLA2单克隆抗体溶液和ALP标记的 Lp-PLA2单克隆抗体溶液混合温育，同时将待测样本或校准品、FITC标记的CRP单克隆 抗体溶液分别与和ALP标记的CRP单克隆抗体溶液混合温育，用多管混匀器振荡混匀，置 37 ±0. 5°C水浴，然后向各个试管中加入抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液， 用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5°C水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接 触，沉淀；倒出上清液，然后加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重 复上述清洗操作，共清洗3次；
[0017] (3)加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用 发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根 据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
[0018] 本发明进一步提出了上述试剂盒在制备用于脑卒中发生后神经功能损伤程度和 梗死体积评价的试剂上的应用。
[0019] 本发明提供的试剂盒的检测原理如图1所示，其中发光标记物1为异硫氰酸荧光 素，发光标记物2为碱性磷酸酶，将待测样本、FITC标记的LP-PLA2单克隆抗体溶液和ALP 标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液混合温育，同时将待测样本、FITC标记的CRP单克隆抗体 溶液分别与和ALP标记的CRP单克隆抗体溶液混合温育。然后加入包被有抗FITC多克隆 抗体的磁微粒，然后加入包被有抗FITC多克隆抗体的磁微粒，免疫复合物被吸附到磁微粒 表面。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强 度（RLU)。在一定范围内RLU与Lp-PLA2与CRP抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准 曲线上读取待测样本中的Lp-PLA2与CRP含量